[发明专利]一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法，其特征在于它的步骤包括膜过滤采集总菌、叠氮化钠处理采集到的总菌和环介导等温基因扩增测定；所述活的副溶血性弧菌包括可培养状态和非可培养状态；

所述的膜过滤采集总菌的步骤，指原位收集待测定海水；采用孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤采集海水中总菌；

所述的叠氮化钠处理采集到的总菌的步骤，指首先采用细胞释放溶液将微孔滤膜上的总菌洗脱到容器里，加入叠氮化钠溶液，自然光条件下反应20min，获得总菌悬浮液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的环介导等温基因扩增测定的步骤，指以叠氮化钠处理过的总菌悬浮液为生化扩增反应模板，然后加入包括引物、酶在内的扩增反应试剂和指示剂，封闭反应管，放入61-65℃下反应；同时做阳性和阴性对照，指示剂颜色变化指示环介导等温基因扩增结果。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的指示剂为GeneFinder核酸染料。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的各步骤，均采用无菌的洁净器具。

5.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法，其特征在于它的具体步骤如下：

1)清洗、灭菌所有需要的器具，使用前密封保存；

2)用60mL一次性无菌注射器抽取海水样品50mL，然后装上直径13mm、孔径0.45μm水系微孔滤器，缓慢推出海水；

3)从滤器中取出滤膜放入5mL离心管，加入1mL细胞释放溶液，手动震荡1min，将滤膜上所得总菌洗脱到离心管内溶液中；

4)向上述离心管溶液中加入10μL10 mmol/L叠氮化钠，摇匀，自然光下反应20min，获得总菌悬浮液；

5)向0.2mL薄壁PCR管中加入环介导等温基因扩增试剂，制得生化反应混合液；25μL的反应体系包括各1.6μmol/L的引物FIP和BIP，各0.8μmol/L的引物LF和LB，各0.2μmol/L的引物F3和B3，1.4mmol/L的dNTPs，6.0mmol/L的MgSO₄和1×缓冲液；其中引物针对副溶血性弧菌的tlh基因，序列分别为(5’-3’)：

F3：AGC TAC TCG AAA GAT GAT CC；

B3：GGT TGT ATG AGA AGC GAT TG；

FIP：ATGTTTTTA AATGAA ACGGAGCTCCGGCAAAAA ACG AAG ATG GT；

BIP：ACG TCG CAA AAC GTT ATC CGG CGA AGA ACG TAA TGT CTG；

LF：ACC AGT AGC CGT CAA TG；

LB：TTA GAT TTG GCG AAC GAG A；

6)取5μL模板溶液加入上述生化反应混合液中，不盖PCR管盖子，轻微振动混匀；随后将反应管放入高于95℃的水中10min，取出后冷却至室温；

7)向PCR管内溶液中加入1μL Bst2.0 DNA聚合酶，不盖PCR管盖子，轻微振动混匀；

8)向PCR管盖子内部均匀涂上1μL GeneFinder核酸染料，然后盖上盖子，并将PCR管置于64℃水浴中反应60min；

9)取出PCR管，上下颠倒几次或者剧烈震荡，使GeneFinder核酸染料混入环介导等温基因扩增生化反应液；

10)结果判断：自然光条件下，PCR管中反应后混合液如果显示橙色，表明待测海水中不含副溶血性弧菌；显示绿色，表明待测海水中含有活的副溶血性弧菌。