[发明专利]一种反义长链非编码RNA在制备基因治疗剂方面的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种反义长链非编码RNA在制备基因治疗剂方面的应用。

背景技术

天然反义RNA(natural antisense transcripts,NATs)是在多个物种中表达的RNA分子，可与正义RNA进行互补配对形成天然双链RNA，通过不同的机制调控正义基因的表达。天然反义RNA在细胞增殖、分化等过程中起重要调控作用，与肿瘤、心血管等疾病密切相关。目前为止，人们对反义RNA及其功能的研究还只是一隅之见，但已为科研者对于基因表达和肿瘤的发生机制开拓了新的视野。

肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)是一种转录因子，调节骨骼肌细胞、免疫细胞中多个基因的转录。MEF2D为MEF2家族中的一员，它在细胞的存活与分化方面有非常重要的作用。有研究表明，MEF2D不仅能促进VEGF信号通路的活化，对细胞的增殖能力也有一定的提高，对肝细胞癌(HCC)的发生发展有着重要作用。

由于人们对肝癌与反义RNA关系的高度关注，越来越多与肝癌相关的反义RNA被发现并深入研究；与此同时，它们在肝癌中的作用机制将逐渐被丰富，有望帮助人们对肝癌的发生、发展做进一步的了解，并期待在肝癌的预测、诊断、预后和治疗中有新的突破。

本发明通过对HepG2肝癌细胞双链RNA文库进行研究，得到一种MEF2D反义RNA，其对MEF2D基因的表达有明显的抑制作用，命名为MEF2D-AS。

发明内容

本发明提供一种反义长链非编码RNA(命名为MEF2D-AS)，其特征在于MEF2D-AS的cDNA序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明提供一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括MEF2D基因的正、反义特异性引物：5′-TTACCAGTTGACCAGTGCAG-3′和5′-TTGCCAGGCAGTGACATT-3′。

本发明的另一实施方案提供上述MEF2D基因的正、反义特异性引物在制备检测肝癌细胞HepG2中MEF2D-AS表达量试剂盒中的应用。

本发明提供2条特异性引物：

3’GSP：5′-TGAGAGATACAGGGACCAGGTGGGA-3′

5’GSP：5′-TCCTCCTTACCAGCCTTTAGTTCACCT-3′。

本发明的另一技术方案提供上述特异性引物3’GSP和5’GSP在测定MEF2D-AS全长序列中的应用。

本发明提供一种测定MEF2D-AS全长序列的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)总RNA的提取；

(2)以3'CDS primer为特异性逆转录引物对总RNA进行特异性逆转录，合成第一链cDNA后，以特异性引物和试剂盒引物进行PCR扩增以获得MEF2D-AS cDNA3'端，即3'-RACE(3'-端扩增产物)；

(3)以5'CDS primer为特异性逆转录引物对总RNA进行特异性逆转录，以特异性引物和试剂盒引物进行PCR扩增以获得MEF2D-AS cDNA5'端，即5'-RACE(5'-端扩增产物)；

(4)将步骤(3)、(4)所有获得的3'-RACE和5'-RACE片段均克隆到pGEM-T Easy载体中，进行序列测定，经测序确定3'-RACE片段长度为800bp，5'-RACE片段长度为662bp；

(5)用DNAMAN V6软件拼接得到长度为1265bp的RNA，通过BLAST发现MEF2D-AS基因转录起始于MEF2D的第8个内含子第100位碱基的反义链配对碱基，完全与MEF2D第8个外显子重叠(241bp)。