[发明专利]一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP引物、试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的 LAMP引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

大豆是世界上重要经济农作物，大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)是大豆生产上的一种重要病原菌，可侵染大豆的根部、茎部和豆荚，引致大豆种腐、根腐和茎枯等。茎部感病后，常在下部茎秆叶、分枝与茎连接处产生病斑，颜色较淡，病斑沿茎扩展、环茎，失水褪绿、萎缩和干枯，导致植株上部萎蔫和枯死，叶片不脱落；病株根系完整、健康；发病较轻植株，上部叶片沿脉间褪绿。豆荚或种子感染后，发病的种子会出现皱缩、伸长、破裂、发白，影响种子质量，造成大豆品质下降，并可能导致大豆种子不能发芽或发芽缓慢，重发时能造成90％的种子不能萌发或腐烂。目前该菌在美国、阿根廷、意大利、韩国、南斯拉夫等都有报道。我国是大豆消费大国，也是大豆贸易大国，每年需大量进口大豆，其中2015年进口大豆达8169万吨，是国内生产量的6.8倍，占国内消费量的87％。进口大豆多来自美国、巴西等大豆种腐病等病害发生较重的国家，而大豆拟茎点种腐病菌常残留在大豆种子和豆荚、豆秆等病残体上，并通过远距离运输而传播蔓延，因此，我国存在较大的拟茎点种腐病菌输入风险。大豆拟茎点种腐病菌侵染到大豆组织后具有一定的潜育期，并未显症或症状不明显，常导致漏诊或误诊。在这种严峻的形势下，快速准确地检测病原菌和诊断病害是控制病害成灾的主要措施之一。

拟茎点霉属真菌检测与鉴定的方法主要有形态学鉴定、血清学方法和分子生物学方法等。目前拟茎点霉属传统的检测方法主要以形态学监测为基础，即：将待鉴定菌株接种在培养基上或其寄主上培养，利用光学显微镜和电子显微镜等仪器观察菌落特征、菌丝形态、产孢结构和孢子结构等表型特征，结合寄主上的发病症状，对照相关资料，再确定该菌的分类地位。这种方法需要较长的时间，且需大量的形态观察，无疑加大了检测难度。血清学检测方法主要是ELISA法，该技术目前已广泛应用于植物病毒检测中，但在真菌检测中并不普遍，同时，由于血清制备困难、近似种特异性差及检测成本过高，以及成品试剂盒不易获得等原因，ELISA方法在拟茎点霉真菌检测上的应用很少。用于拟茎点霉属真菌分子检测鉴定的常用方法包括PCR、多重PCR、巢式PCR、荧光PCR、RLFP、RAPD、 SSR等，近年来，DNA指纹、基因芯片技术等亦开始起步，虽然这些分子检测技术的效率高、灵敏度高，且能从植物组织中直接检测到病原菌，但大部分技术又存在重复性、可操作性、多态性、成本、检测范围及环境因素等问题，例如巢式PCR、多重PCR需要染胶处理，实时荧光PCR因荧光染料和荧光探针的价格及仪器价格等因素使得检测成本较高，RAPD只能对室内纯培养的菌进行检测，而在自然界的发病植株中，往往会感染多种真菌，这会导致分子检测结果不全面，只能检测到某种或某几种病原菌。因此，这些检测技术并未能得到普遍应用。

2000年，Notomi等人研发出了一项全新的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP,loop-mediated isothermal amplification)。该技术使用四条或六条引物，以Bst DNA聚合酶作为扩增酶，恒温条件下对目标片段进行扩增。其产物可以通过凝胶电泳进行观察，同时可以通过田间显色反应指示剂目测直接进行观察。LAMP技术的发明，为病原物快速检测建立了一个良好的平台，该技术具有非常鲜明的特点，不需要模板核酸片段的热变性、长时间的温度变化循环、实验结果不需要凝胶电泳染色后进行紫外观察，这就避免了普通PCR所需要昂贵的实验仪器以及专业的实验操作场所，因而该技术适合在基层、进出口检疫部门进行快速的病原物诊断。

发展分子检测最重要的一点就是选用合适的分子检测靶标。钙调素 (Calmodulin,CaM)编码基因在进化较为保守，其外显子区域在属间具有一定的保守性，同时该基因存在序列差异较大的非编码的内含子区域，该区域在碱基水平上具有明显的种间差异，因此该编码基因可以用来作为分子检测的靶标而加以应用。本发明通过序列比对分析大豆拟茎点种腐病菌和其他拟茎点霉病菌及大豆常发病原菌在CaM基因序列上的差异，设计了大豆拟茎点种腐病菌特异性的 LAMP引物，在此基础上建立了大豆拟茎点种腐病菌LAMP快速检测试剂盒。本发明能实现拟茎点种腐病菌引致病害的早期准确诊断，对及时采取防控措施、减少农药使用、保障大豆生产安全和质量安全具有重要作用。

发明内容