[发明专利]一种水体微生物污染来源定量解析方法

说明书

本发明公开了一种水体微生物污染来源定量解析方法，选取针对目标区域具有特异性强、灵敏度高且可定量分析的特异性生物标记引物，通过qPCR扩增技术构建标准曲线方程。再采集实际水域样品，提取水样品中的基因组DNA；采用区域特异性引物进行qPCR扩增，结果代入标准曲线方程进行计算，得出目标水域中各微生物的浓度值，根据各微生物的浓度值来解析区域目标水域的污染源。通过本发明的方法可识别低浓度的目标微生物，适用于不同水质的环境水体，为环境水体的监测、溯源和治理提供了可靠的依据。

技术领域

本发明总体涉及环境监测技术，具体涉及一种水体微生物污染来源定量解析方法。

背景技术

未经处理(或未完全处理)人和畜禽粪便污染是造成水体微生物污染的最主要原因，如何快速准确区分水体中微生物污染的主要来源并及时有效的进行针对性源头控制是解决问题的关键环节。目前我国基本符合标准的饮用水水源仅占30％左右，且类型以生物污染为主(69.1％)，远高于化学污染的比例。

世界各国通常将粪大肠菌群或大肠埃希氏菌作为指示微生物，以反映水体微生物污染状况，但这些传统指标仅能反映出粪便污染的程度，不能识别污染的确切来源，更不能评价不同污染源的各自贡献率。由于缺乏粪便污染来源的准确信息使得目前治理仍停留在见污治污阶段，极大增加了污染治理的难度与成本。

近年来，欧美等发达国家纷纷开展了以宿主特异性生物标记为基础的水体微生物污染源解析的研究工作，并已开发出了猪、牛、人、鸡、野禽等动物的多种特异性引物，及时提供粪便污染来源的准确信息以及时有效的进行针对性源头控制。然而，宿主消化道内各种肠道菌群之间的相互作用极为复杂，并且外界环境的差异性易导致消化道内菌群的基因发生变化，造成不同地区特异性基因表达差异的现象较为普遍，同一引物在不同地区的特异性可能存在很大差异，且环境的演变过程无法通过单个基因完全表现出来，因此应积极开展地域适应性的生物标记研究。迄今为止，在我国尚未见到利用荧光定量PCR技术(qPCR)对水体中人、牛、猪及鸡等动物的粪便污染进行定量识别的研究，也没有相关的专利技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种水体微生物污染来源定量解析方法，该方法可识别低浓度的目标微生物，数据可靠。

本发明基于拟杆菌宿主特异性生物标记引物溯源法，采用qPCR技术定量分析环境水体中微生物污染物的主要宿主来源，包括如下步骤：

(1)引物区域性验证：

在区域目标水域周边采集不同生物的粪便样品，样品采集后保存于冰盒中，6h内送回实验室进行后续处理；

采用粪便基因组DNA提取试剂盒通过悬浮、破碎、吸附柱纯化等步骤从粪便样品中提取基因组DNA，置于-20℃冰箱储存；

以各生物粪便中提取的基因组DNA为模板，选取已有的各生物拟杆菌特异性引物分别进行qPCR扩增，分析引物的灵敏度与特异性；选取灵敏度和特异性都在85％以上的引物作为区域特异性引物；

(2)标准曲线制作：

以区域特异性引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增后的目标产物进行纯化回收，连接到pMD 19-T Vector载体上，转化DH5 α感受态细胞，采用含有氨苄抗生素的平板培养基挑取阳性克隆，提取质粒DNA，测定其浓度；

将质粒10倍梯度稀释，稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 7个梯度，并以此为模板，每个梯度作为标准品设3个重复，进行qPCR扩增；反应结束之后，进行标准曲线的制作；

(3)污染源解析：