[发明专利]利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素AD的方法及其制备方法

说明书

技术领域

本项发明涉及的是一种生物制剂的制备方法，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素AD的方法及其制备方法。

背景技术

广谱抗生素的大量使用不仅导致了耐药菌在世界范围内频繁出现，而且其在清除病原菌的同时也杀灭了正常细菌，对机体微生态平衡造成了严重破坏，在临床上经常出现继发感染等负面后果。抗菌肽以其卓越的抗菌活性及独特的作用机制而倍受青睐。抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMP)，又称为宿主防御肽(Host Defense Peptide，HDP)，是机体先天免疫系统的重要组成部分，是保护宿主抵御外源病菌侵入的屏障。抗菌肽来源广泛，具有调节免疫，广谱杀灭细菌、真菌、病毒、寄生虫、癌细胞等多方面的生物学功能。此外，抗菌肽特殊的作用机制成为新一代抗菌药物的潜质。天蚕素AD是人工设计的由天蚕素A的N端1～11片段和天蚕素D的C端12～37片段组成的杂合肽，据测定，化学合成的天蚕素AD，其杀菌活性和抗茵谱都明显高于天然抗茵肽(杀菌活性是抗茵肽D的5～55倍，对枯草杆菌的活性是抗菌肽A的6倍)目前已有多种方法被用于天蚕抗菌肽AD的基因表达，但都存在成本较高、分离纯化困难的问题。

获取抗菌肽主要通过以下途径，一是从生物体内直接提取、二是应用化学合成技术生产，三是通过基因工程技术进行制备。但由于天然抗菌肽含量少，直接提取不仅难度大还受到技术的限制；化学合成成本高，很难形成规模化生产。随着基因工程技术的成熟，通过重组技术表达外源蛋白成为可能，因此借助基因工程技术手段，构建生物反应器实现抗菌肽的规模化廉价生产，最终实现抗菌肽的广泛应用，对于促进绿色农业与畜牧业发展有重要意义。本项发明选用枯草芽孢杆菌做为表达宿主菌，表达系统中使用高效启动子Pglv，利用廉价无污染且容易获得的麦芽糖作为诱导剂成功的表达了抗菌肽CAD。为今后开发全新高效抗菌肽类饲料添加剂提供理论基础与实验依据。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素AD的方法及其制备方法，利用基因工程技术在枯草芽孢杆菌中表达了天蚕素AD。

本发明所采用的技术如下：一种利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素AD的方法，如下：

(1)、基因合成：人工设计编码目的基因片段，在天蚕素AD基因上游融合信号肽SPsacB基因、六个组氨酸基因、SUMO标签，并在5’端加上EcoRI酶切位点，在3’端加上终止密码子和BamHI酶切位点，整条融合基因SPsacB-6×His-SUMO-Cecropin AD，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)、表达质粒的构建及转化：表达载体以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148作为骨架，启动子为麦芽糖启动子Pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB800N作为表达宿主菌，利用化学转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N中，表达产物经过纯化蛋白酶切后进行Tricine-SDS-PAGE定性和质谱检测分析，实现融合蛋白的表达。

本发明还具有如下技术特征：一种利用枯草芽孢杆菌制备天蚕素AD的方法，如下：

(1)、人工设计编码目的基因片段，在天蚕素AD基因上游融合信号肽SPsacB基因、六个组氨酸基因、SUMO标签，并在5’端加上EcoRI酶切位点，在3’端加上终止密码子和BamHI酶切位点，整条融合基因SPsacB-6×His-SUMO-Cecropin AD，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)、表达载体以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148作为骨架，启动子为麦芽糖启动子Pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB800N作为表达宿主菌，利用化学转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N中，表达产物经过纯化蛋白酶切后进行Tricine-SDS-PAGE定性和质谱检测分析，实现融合蛋白的表达；

(3)、诱导发酵

分别挑取阳性重组子单菌落分别接种于含氯霉素、新霉素各10μg/mL的10mL LB培养基中，37℃，220rpm条件下过夜振荡培养，按体积比为1％的接种量转接到50mL新鲜LB培养基中，37℃，220rpm条件下振荡培养，发酵4h后加入最终质量浓度为6％的麦芽糖后进行诱导表达，48h后收集菌液上清；

(4)、融合蛋白的纯化