[发明专利]利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素AD的方法及其制备方法

权利要求书

1.一种利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素AD的方法，其特征在于，方法如下：

(1)、基因合成：人工设计编码目的基因片段，在天蚕素AD基因上游融合信号肽SPsacB基因、六个组氨酸基因、SUMO标签，并在5’端加上EcoRI酶切位点，在3’端加上终止密码子和BamHI酶切位点，整条融合基因SPsacB-6×His-SUMO-Cecropin AD，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)、表达质粒的构建及转化：表达载体以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148作为骨架，启动子为麦芽糖启动子Pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB800N作为表达宿主菌，利用化学转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N中，表达产物经过纯化蛋白酶切后进行Tricine-SDS-PAGE定性和质谱检测分析，实现融合蛋白的表达。

2.一种利用枯草芽孢杆菌制备天蚕素AD的方法，其特征在于，方法如下：

(1)、人工设计编码目的基因片段，在天蚕素AD基因上游融合信号肽SPsacB基因、六个组氨酸基因、SUMO标签，并在5’端加上EcoRI酶切位点，在3’端加上终止密码子和BamHI酶切位点，整条融合基因SPsacB-6×His-SUMO-Cecropin AD，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)、表达载体以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148作为骨架，启动子为麦芽糖启动子Pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB800N作为表达宿主菌，利用化学转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N中，表达产物经过纯化蛋白酶切后进行Tricine-SDS-PAGE定性和质谱检测分析，实现融合蛋白的表达；

(3)、诱导发酵

分别挑取阳性重组子单菌落分别接种于含氯霉素、新霉素各10μg/mL的10mL LB培养基中，37℃，220rpm条件下过夜振荡培养，按体积比为1％的接种量转接到50mL新鲜LB培养基中，37℃，220rpm条件下振荡培养，发酵4h后加入终质量浓度为6％的麦芽糖后进行诱导表达，48h后收集菌液上清；

(4)、融合蛋白的纯化

收集菌液上清后混合5×Bindding Buffer，Bindding Buffer含有20mM Tris、500mM NaCl、和20mM咪唑，过NI-NTA柱，用含20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、500mM咪唑的Washing Buffer，进行梯度洗脱；

(5)、纯化

将纯化后的融合蛋白在SUMO酶切Buffer中透析后，进行4℃过夜酶切，将酶切体系过NI-NTA，重组蛋白在穿流液中获得，用去离子水透析，冻干后即获得重组蛋白纯品。