[发明专利]一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法

说明书

本发明公开了一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法，属于工业微生物技术领域。以酿酒酵母NJZCC17和NJZSC5作为出发菌株，进行单倍体分离，通过分别敲除单倍体的ALD6基因，得到基因改良菌株，将基因改良后的17A24‑ald6△(MATa)菌株和5125‑ald6△(MATα)菌株进行二倍体杂交融合，得到二倍体杂交菌株NJZ17A5‑ald6△。该酿酒酵母在酒精发酵过程中乙酸产量降低，而碳代谢流更多地转向生成并积累甘油；乙酸乙酯的产量降低；异戊醇和2‑苯乙醇产量分别提高。因此，为葡萄酒酿造工业提供了一种降低乙酸产量的同时又能提高甘油产量的新方法。

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法。

背景技术

随着我国综合国力和人民生活水平的显著提高，葡萄酒消费额度逐年上升，市场逐年扩大。正常情况下，葡萄酒中的挥发酸在0.4～0.6g/L之间，不应超过1.1g/L。其含量的变化可以看作葡萄酒酿造和储藏健康状况的“晴雨表”。过高的挥发酸含量会严重影响葡萄酒的感官品质，使葡萄酒在品尝时产生令人不愉快的灼热感和呛人的刺激气味，嗅闻时会产生刺鼻的酸味，掩盖葡萄酒的其他香气。葡萄酒中主要的挥发性有机酸是乙酸，可以占到总挥发酸的80～90％以上。因此控制乙酸的产量便可以很好的控制总挥发酸量。甘油是酿酒酵母产生的对葡萄酒感官特性影响最大的副产物。甘油不仅可以赋予葡萄酒淡淡的甜味，而且赋予葡萄酒柔润、醇厚和如履丝绒的口感，对酒体的典型性也起到重要作用。甘油在葡萄酒中的含量为3～9g/L，其含量的多少在葡萄原料相同的前提下取决于所采用的酿造技术和酿酒酵母菌株。

在酿酒酵母中，乙酸是由丙酮酸脱氢酶支路(PDH)的关键酶乙醛脱氢酶系(ACDH)产生的。丙酮酸脱氢酶支路在丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶系(ACDH)和乙酰辅酶A合成酶等酶的作用下经过一系列反应将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。ACDH可将PDH中间产物乙醛氧化为乙酸。Ald6p是ACDH酶系中主要的细胞浆质乙醛脱氢酶，其由ALD6基因编码，也是乙酸产生的关键酶；其同工酶Ald4p为主要的线粒体乙醛脱氢酶，在ALD6基因缺失时，由ALD4基因编码并补偿由于ALD6缺失造成的代谢失衡。

在葡萄酒酿造工业筛选乙酸产量低而甘油产量高的酿酒酵母菌株是广大科研工作者的主要兴趣所在。

发明内容

本发明的目的旨在解决由于酿酒酵母在葡萄酒酒精发酵过程中乙酸含量过高而甘油含量偏低的问题，而提供了一种基因敲除的高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法。

本发明的第一方面，提供一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株的构建方法，按照以下步骤进行：

1)、以酿酒酵母NJZCC17(专利保藏号：CGMCC 3284)和NJZSC5(专利保藏号：CGMCCNo.3732)作为出发菌株，进行单倍体分离，筛选得到两株单倍体菌株，分别命名为17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和5125(MATα)单倍体酿酒酵母；

2)、采用基因敲除技术，利用pUG6质粒对17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和5125(MATα)单倍体酿酒酵母的ALD6基因分别进行敲除；再利用pSH65质粒对两端带有loxP位点的G418抗性基因KanMX分别进行敲除；得到基因改良菌株17A24-ald6△(MATa)和5125-ald6△(MATα)；

3)、将野生型17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和野生型5125(MATα)单倍体酿酒酵母，及基因改良后的17A24-ald6△(MATa)菌株和5125-ald6△(MATα)菌株进行二倍体杂交融合，最后得到NJZ17A5和NJZ17A5-ald6△两株新的二倍体杂交菌株。

进一步地，上述步骤2)所述ALD6基因敲除是采用pUG6质粒对ALD6基因进行敲除，所设计的敲除质粒的引物为：

上游引物：