[发明专利]一种转抗菌肽PR39基因小鼠

权利要求书

1.一种转抗菌肽PR39基因小鼠，其特征在于，所述抗菌肽PR39基因整合在所述转抗菌肽PR39基因小鼠的第13号染色体上。

2.根据权利要求1所述的转抗菌肽PR39基因小鼠，其特征在于，所述抗菌肽PR39基因位于转基因小鼠的第13染色体上的GM36264基因与GM8784基因之间。

3.根据权利要求2所述的转抗菌肽PR39基因小鼠，其特征在于，所述的转抗菌肽PR39基因小鼠是通过如下步骤获得的：

(1)根据PR39基因CDS序列，在基因序列两端增加酶切位点，人工合成相应的DNA序列；

(2)将合成的DNA序列连接到pCMS-EGFP空载体上，获得抗菌肽PR39基因表达载体pCMS-EGFP-PR39；

(3)对抗菌肽PR39基因表达载体pCMS-EGFP-PR39进行功能验证；

(4)将能有效表达PR39基因的表达载体pCMS-EGFP-PR39显微注射小鼠受精卵雄原核，并将注射后的受精卵移植至代孕母鼠子宫内，经过妊娠获得F0代转基因小鼠；

(5)对获得的F0代转基因小鼠进行检测，选取PR39基因表达量高，且整合位点单一的个体进行后续研究；

(6)将筛选出的F0代个体与野生型小鼠配种繁殖，获得F1代转基因小鼠；

(7)对获得的F1代转基因小鼠进行检测，筛选出能稳定遗传且高效表达PR39基因的个体进行整合位点分析，并用于后续研究；

(8)对筛选出的F1代个体进行繁殖，获得相应的家系，并对该家系进行抗细菌实验，得到能有效抵抗细菌的转抗菌肽PR39基因小鼠。

4.根据权利要求3所述的转抗菌肽PR39基因小鼠，其特征在于，所述抗菌肽PR39基因表达载体pCMS-EGFP-PR39基因序列为SEQ ID NO:1。

5.根据权利要求3所述的转抗菌肽PR39基因小鼠，其特征在于，所述步骤(3)包括将表达载体转染293细胞后，进行qPCR检测及抑菌效果检测。

6.根据权利要求5所述的转抗菌肽PR39基因小鼠，其特征在于，所述的qPCR检测，包括如下步骤：

(1)pCMS-EGFP-PR39表达载体转染293细胞，24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况；

(2)72h后，收集细胞提取RNA；

(3)对提取的RNA进行qPCR检测，qRCP反应程序为42℃15min，95℃3min。

7.根据权利要求5所述的转抗菌肽PR39基因小鼠，其特征在于，所述的抑菌效果检测包括如下步骤：

(1)pCMS-EGFP-PR39表达载体转染293细胞和空白对照组未转染的293细胞培养48h后，用无血清培养基培养细胞24h，收集培养基，将培养基用弹性蛋白酶处理；

(2)大肠杆菌的制备：在大肠杆菌板中挑取单个菌落，接种于5ml LB液体培养基中，置于37℃，220r/min摇床中培养18-24h，吸取50ul菌液于新的5ml LB液体培养基中扩大培养3h，吸取1ml菌液于转速为2000g的离心机中离心5min，倒掉上清液，用PBS重悬，吸取200ul于96孔板中，使用酶标仪进行OD值检测，选用菌液浓度为：2×10⁶CFU/ml；

(3)抑菌实验步骤：用96孔板，每孔加入25ul浓度为2×10⁶CFU/ml的大肠杆菌菌液，然后加入25ul经步骤(1)处理后的培养基混匀，放置于37℃培养箱中培养3h，每孔加入200ul LB液体培养基，37℃培养箱中过夜培养，第二天用酶标仪检测其OD值，根据OD值的大小，来判定pCMS-EGFP-PR39表达载体的抑菌效果。

8.根据权利要求3所述的转抗菌肽PR39基因小鼠，其特征在于，所述步骤(5)包括PCR检测及PR39基因mRNA表达量检测。