[发明专利]一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域和临床检测诊断领域，尤其涉及一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒及其方法。

背景技术

肺癌是当今最常见的恶性肿瘤之一，也是高致死率的癌症之一，其中80～85％的患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)。根据《2012中国肿瘤登记年报》报道，我国癌症发病率和死亡率分别为286/10万人和181/10人万，相当于每分钟就有5～6个人确诊癌症，平均每5位癌症患者3个人死亡。在我国所有的肿瘤类别中，肺癌发病率和死亡率高居第一，高达54/10万人和45/10万人，换句话说，每分钟确诊的6位癌症患者中，就有1位是肺癌，并且死亡率极高。

以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶点，实施小分子基因靶点向药物(如易瑞沙)治疗，在非小细胞肺癌的治疗中日渐突出。大量研究表明，EGFR突变与TKI疗效具有相关性，因此并非所有肺癌患者都可以从TKI(酪氨酸激酶抑制剂)治疗中获益。携带EGFR基因突变的NSCLC患者在接受易瑞沙和特罗凯治疗时疗效显著，但是研究发现EGFR外显子20上的T790M突变位点为耐药位点，会抑制易瑞沙和特罗凯等药物的疗效。同时随着TKI药物在临床的广泛推广和应用，约30～40％患者接受TKI治疗后出现耐药现象，进一步检测发现T790M基因随之发生突变。因此在服用TKI药物之后，需要对T790M突变进行定期监控，以帮助医生选择最佳的治疗方案。

目前大量的文献和研究证实，通过无创性肿瘤诊断的方法可以进行肿瘤的早期诊断，即通过检测肿瘤患者外周血中游离的DNA可以检测到全身各处原发灶的多种异常基因，因此对T790M突变监测可以通过对患者外周血中游离的DNA进行检测。外周血中游离的DNA为大小不一的DNA片段，从几bp到几千bp。但是外周血中游离的DNA在血液中的含量很低，故而T790M突变的DNA含量就更少了，一般从1ml外周血中提取出来的DNA含量低于1ng，约为10～500拷贝左右。目前市场中液体试剂盒的灵敏度和精密度很难达到检测要求，同时在检测的过程中加入5～10μL的DNA模板量，实验结果波动液比较大，因此很多实验室采用数字PCR(ddPCR)进行检测。数字PCR精确度很高，但是其对设备要求高，操作过程困难及通量限制使得其在临床推广上受到了极大的制约。不仅如此，市场上现有的的试剂产品都为液态试剂，在运输和保存过程中对于温度具有严格的要求，具有明显的略势。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种检测外周血中游离DNA的EGFR基因T790M突变的试剂盒及其方法，提高检测的准确度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的组合物，其包括检测T790M的引物对和探针，其中，检测T790M的引物对由SEQ ID NO：1所示序列的上游引物和SEQ ID NO：2所示序列的下游引物组成，检测T790M的探针为SEQ ID NO：3所示序列。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，上述用于检测外周血EGFR基因T790M突变的组合物还包括内参引物对和内参探针，其中，所述内参引物对由SEQ ID NO：4所示序列的上游引物和SEQ ID NO：5所示序列的下游引物组成，所述内参探针为SEQ ID NO：6所示序列。

优选地，所有探针的5’-端标记荧光基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、JOE、CY3、TAMRA；所有探针的的3’-端标记淬灭基团，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA；其中检测T790M的探针和内参探针的荧光基团不同；更优选地，检测T790M的探针5’-端标记FAM，内参探针5’-端标记HEX。

各引物及探针的核苷酸序列如表1所示。

表1引物及探针核苷酸序列表

本发明还提供一种含有上述组合物的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的检测体系。

优选地，该检测体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其还包括冻干骨架，冻干保护剂，dNTPs和酶混合液。