[发明专利]一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的组合物，其特征在于，包括检测T790M的引物对和探针，其中，检测T790M的引物对由SEQ ID NO：1所示序列的上游引物和SEQ ID NO：2所示序列的下游引物组成，检测T790M的探针为SEQ ID NO：3所示序列。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括内参引物对和内参探针，其中，所述内参引物对由SEQ ID NO：4所示序列的上游引物和SEQ ID NO：5所示序列的下游引物组成，所述内参探针为SEQ ID NO：6所示序列。

3.根据权利要求2所述的所述的组合物，其特征在于，所有探针的5’-端标记荧光基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、JOE、CY3、TAMRA；所有探针的的3’-端标记淬灭基团，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA；其中检测T790M的探针和内参探针的荧光基团不同。

4.一种含有如权利要求1～3中任一项所述的组合物的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的检测体系。

5.根据权利要求4所述的检测体系，其特征在于，该检测体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其还包括冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。

6.根据权利要求5所述的检测体系，其特征在于，所述冻干骨架包括0.1％～0.5％甲基纤维素和/或0.5％～5％聚乙烯吡咯烷酮；所述冻干保护剂包括1％～5％的海藻糖；所述dNTPs包括0.1～0.3mM的dATP、dCTP、dGTP和dUTP；所述酶混合液包括1～3U HOT start Taq DNA聚合酶、1～2U UNG酶。

7.一种含有如权利要求1～3中任一项所述的组合物的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒。

8.一种用于非诊断和非治疗目的的采用权利要求7所述的试剂盒来检测外周血EGFR基因T790M突变的方法，其特征在于，包括如下所述的荧光PCR反应体系的冻干程度：

1)将预先配置的荧光PCR反应体系按50μL分装到八联排管中；

2)-60℃预冻4h；

3)-45℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为20h；

4)25℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为2h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括如下所述的荧光PCR反应体系的扩增程序：UNG酶反应50℃2min，1个循环；Taq酶活化95℃10min，1个循环；变性95℃15秒，退火、延伸62℃50秒，10个循环；变性95℃15秒，退火、延伸、荧光采集58℃45秒，35个循环；仪器冷却37℃2min，1个循环。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括荧光PCR反应体系的扩增程序检测结果的分析，在此反应体系中，检测T790M的探针在5’-端标记荧光基团FAM，内参探针在5’-端标记荧光基团HEX，该检测结果的分析包括如下步骤：

I)阴性对照无“S”曲线；

II)阳性对照有“S”曲线，且Ct值小于25；

III)样本孔HEX通道观察到扩增曲线，且Ct值小于30；

同时满足上述要求后，样本孔FAM通道观察到扩增曲线，且Ct_HEX-Ct_FAM绝对值<15循环，则样本中含有T790M突变。