[发明专利]具有DPP-IV抑制活性的牦牛骨蛋白肽及制备方法

权利要求书

1.一种具有DPP-IV抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽，其特征在于，所述牦牛骨蛋白肽采用如下方法制备：

1)以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液，将制得的牦牛骨蛋白液经频率为50-80kH的超声波超声处理15-25分钟以改变牦牛骨蛋白的组织结构；

2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解且不添加酸和碱，所述复合蛋白酶分步酶解包括以下步骤：第一步酶解反应：向蛋白重量6-9wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一复合蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h，其中，第一复合蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶；第二步酶解反应：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5％第二复合蛋白酶，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h，其中，第二复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶；

3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得；

其中，所述牦牛骨蛋白肽的整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，所述步骤3)中除杂具体为：

在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；

所述步骤3)中膜分离具体为：将除杂后的产物通过两步超滤方法进行处理，先后利用孔径为10000道尔顿的膜和孔径为5000道尔顿的膜进行超滤；

所述步骤3)中凝胶分离和反相HPLC具体为：

将膜分离后的产物经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9-13分钟的肽洗脱液；

所述牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的含量为45%的多肽：

Val-Leu-Gly-Leu-Val-Arg，

Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Ala-Arg，

和Leu-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys。

2.制备权利要求1所述的牦牛骨蛋白肽的方法，包括以下步骤：

1)以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液，将制得的牦牛骨蛋白液经频率为50-80kH的超声波超声处理15-25分钟以改变牦牛骨蛋白的组织结构；

2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解且不添加酸和碱，所述复合蛋白酶分步酶解包括以下步骤：第一步酶解反应：向蛋白重量6-9wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一复合蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h，其中，第一复合蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶；第二步酶解反应：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5％第二复合蛋白酶，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h，其中，第二复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶；

3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得；

其中，所述牦牛骨蛋白肽的整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，所述步骤3)中除杂具体为：

在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；

所述步骤3)中膜分离具体为：将除杂后的产物通过两步超滤方法进行处理，先后利用孔径为10000道尔顿的膜和孔径为5000道尔顿的膜进行超滤；

所述步骤3)中凝胶分离和反相HPLC具体为：

将膜分离后的产物经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9-13分钟的肽洗脱液。

3.权利要求1所述的牦牛骨蛋白肽在制备预防或治疗受益于DPP-IV抑制和/或抗氧化的疾病的药物或食品中的应用。