[发明专利]一种大豆蛋白的应用及其制备方法和表达载体、引物

权利要求书

1.一种大豆蛋白的应用，其特征在于，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，将所述大豆蛋白用于制备LDH酶冻干保护剂。

2.一种如权利要求1所述的大豆蛋白的应用，其特征在于，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，所述大豆蛋白通过以下步骤制备：

扩增目的基因：以F：3’- ATGGCGAGCGCAGTGGAGAAG -5’；R：3’-TCAGCTCTCGTGAGTGCCATTC-5’作为引物，以大豆R0期胚根cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因片段，目的基因片段的基因序列如SEQ ID NO.4所示；

构建重组质粒：将目的基因片段与经Nde I和Xho I双酶切的蛋白表达载体PET-28a，通过T4连接酶连接酶切产物，构建pET-28a重组质粒；

转化感受态细胞：将pET-28a重组质粒转化大肠杆菌BL21 Star 感受态细胞；

诱导表达：将含有pET-28a重组质粒的菌株扩大培养，加入1‰IPTG 贮存液过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集，重悬，破碎菌体，离心，取上清液，得总可溶性蛋白；

蛋白分离纯化：对所得的总可溶性蛋白进行亲和层析，分离纯化目的蛋白;

所述构建重组质粒过程中，包括以下步骤：

将目的基因片段和经过双酶切的PET-28a蛋白表达载体按照摩尔比10:1混合，加入0.5μL T4连接酶，1μL 10×Buffer，用水补齐至10μL，16℃连接过夜。

3.根据权利要求2所述的大豆蛋白的应用，其特征在于，诱导表达过程中，包括以下步骤：

将含有pET-28a重组质粒的菌株扩大培养，加入1‰IPTG 贮存液，在16℃下150 rmp过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集，用Balance Buffer重悬，破碎菌体，在4℃，10000 rmp下离心30min，取上清液。

4.根据权利要求3所述的大豆蛋白的应用，其特征在于，蛋白分离纯化过程中，包括以下步骤：

将总可溶性蛋白经镍离子亲和层析，利用蛋白脱盐柱去除蛋白溶液中的咪唑，将脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥，用PBS缓冲液复溶，用分子筛分离纯化凝血酶酶切产物。

5.根据权利要求4所述的大豆蛋白的应用，其特征在于，所述大豆蛋白的表达载体为携带有SEQ ID NO.4所示的大豆蛋白基因，用于表达基因编码为Glyma06g25310.1的大豆蛋白。

6.根据权利要求5所述的大豆蛋白的应用，其特征在于，所述表达载体用PET-28a蛋白表达载体重组得到，该大豆蛋白基因通过酶切位点Nde I和Xho I连接在表达载体上。