[发明专利]一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法

说明书

本发明公开了一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，步骤包括：采用溶胶‑凝胶技术和静电纺丝技术相结合的方法制备CaO‑P₂O₅‑SiO₂体系介孔生物玻璃微纳米纤维，以其作为无机基相；利用基因重组技术制备载有骨细胞调节因子Osterix目的基因的质粒DNA，并以壳聚糖包埋质粒DNA制成微球，作为添加相。配制由生物玻璃微纳米纤维、基因载体微球和PCL等材料构成的乳液体系，利用热致相分离法制备复合Osterix质粒DNA的生物玻璃/PCL仿生骨组织工程支架，由此获得具有基因调控功能的硬组织工程支架。所得硬组织工程支架能够在分子水平上刺激细胞并产生特殊应答反应，可实现对细胞生长基因的精确调控。

技术领域

本发明属于组织工程支架材料领域，涉及一种硬组织工程支架的制备方法，具体涉及一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法。

背景技术

骨缺损是指由先天性或后天性疾病、外伤及人口老龄化等原因而造成的骨骼缺失，是威胁人类健康和生命的严重病症，骨缺损的修复研究是长期以来人们深入关注的重点课题之一。治疗骨缺损的有效方法是自体骨移植、异体骨移植和人造骨移植。传统的自体骨移植仍是目前最理想的骨移植材料，是骨移植的“金标准”，但受到许多限制，如骨来源受限、供区损伤、植骨量不足、不能制备特殊形状等。异体骨的移植则存在疾病传播、生物组织相容性差和免疫排斥等诸多问题。现有的人工骨移植材料主要是金属和陶瓷材料，如羟基磷灰石和磷酸三钙等，这类骨移植材料虽然材料来源不受限制但是无法提供与真实骨骼相似的力学性能，并且缺乏生物响应特性，容易造成手术失败或二次手术。现有的骨组织工程支架无论是在材料的组成、表面物理化学性质还是微观-宏观结构方面均存在一定的不足。一方面，缺乏从基因层面上对细胞在材料表面生长调控的研究；另一方面，现有的支架成型方法往往不能同时在微观和宏观层次上精确调控支架的结构，严重限制了骨组织工程支架材料的研究。

20世纪70年代初，美国佛罗里达大学的Hench教授研制成功用于骨修复的生物活性玻璃(Bioactive Glass,BG，简称生物玻璃Bioglass)，并于90年代初将其成功应用于骨科临床修复骨缺损，取得良好的临床治疗效果，现在已被骨科临床广泛采用。与其它生物活性材料(如羟基磷灰石)相比，生物玻璃被认为具有较高的生物活性和骨结合强度，主要是由于生物玻璃在人体生理环境中可以迅速通过玻璃表面的Na⁺、Ca²⁺元素溶出、水中H⁺进入玻璃表面首先在玻璃表面形成带有负电的硅酸凝胶层，进一步通过诱导沉析和矿化作用在硅酸凝胶层上形成类骨碳酸羟基磷灰石层(Hydroxyl-Carbonate-Apatite,HCA)。研究表明生物玻璃表面的HCA层的形成，可选择性的吸附诸如纤维蛋白等血清蛋白，有利于细胞粘附及成骨细胞表型的表达，并且能直接促使骨祖细胞转化为成骨细胞，具有骨生成作用。目前，骨修复材料中所采用的生物玻璃主要以粉体为主，有学者开始研究静电纺丝法制备无机材料的微纳米纤维结构，并在此基础上进一步研究制备无机-有机复合的微纳米纤维方法，这方面的研究正处于起步阶段，例如在支架的三维结构控制和纤维的微观形貌控制中仍有很多需要解决的问题。

调整改善支架材料和细胞之间的作用对于骨组织工程支架的优化设计具有重要意义。为了使细胞在材料表面有效的粘附、生长与分化，一般通过各种物理、化学和生物改性的方法使支架材料表面的亲水性、粘附细胞的能力发生变化，或者通过加入生长因子(如骨形态发生蛋白BMP-2、转化生长因子TGF及转录因子Osterix等)的方法促进细胞的增殖与分化。单纯通过加入生长因子的方法已经很难满足支架材料的设计需要，更无法实现对细胞生长基因的精确调控，需要开发新型的细胞生长调控方法。由于骨的快速修复依赖于成骨细胞的增殖和分化，只有先活化成骨细胞中的一个基因序列，细胞才能够发生分裂并合成出具有矿化成骨能力的细胞外基质，在成骨细胞对生物材料的细胞应答中存在着一种基因控制，借助基因调控手段，能够在分子水平上刺激细胞并产生特殊应答反应，有望设计出一种新型组织工程支架材料。

为此，有必要开发一种基因调控功能的硬组织工程支架，使其能用于快速的骨修复。