[发明专利]微生物核酸的定性和定量检测

说明书

本申请是申请日为2011年07月27日、中国申请号为201180039653.5、发明名称为“微生物核酸的定性和定量检测”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及使用至少第一对照核酸，或不同浓度的第一和第二对照核酸来定性和定量检测微生物核酸的新的方法和用途。该方法基于核酸的扩增，优选地，聚合酶链式反应。进一步提供了包含用于实施所述方法和用途的组分的试剂盒。

发明背景

在分子诊断学领域中，使用核酸扩增反应对微生物核酸进行检测和量化发挥重要的作用。针对丙肝病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、和/或乙肝病毒(HBV)的存在的献血常规筛选是核酸扩增和检测反应大规模应用的一个例子。后者包含多种不同技术，最常使用的技术是由Kary Mullis在1984年引入的聚合酶链式反应(PCR)。基于PCR的分析的自动化系统经常利用PCR过程期间对产物扩增的实时检测。这类方法的关键是使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。

生物学样品中微生物核酸的定性检测对于例如识别个体感染是至关重要的。由此，用于检测微生物感染的测定法的一项重要的要求是避免假阴性或假阳性结果，因为这类结果几乎会不可避免地导致就相应患者的治疗而言的严重后果。因此，特别是在基于PCR的方法中，向检测混合物添加定性内部对照核酸。所述对照对于确定测试结果的有效性是特别重要的：至少在就微生物核酸而言阴性结果的情况中，定性内部对照反应在给定背景内必须表现为反应性的，即必须检测出定性内部对照，否则认为该测试自身是不起作用的。然而，在定性设置中，在阳性结果的情况中没有必要必须检出所述定性内部对照。对于定性测试，特别重要的是，保证反应的灵敏度，并且因此对其严格控制。因此，定性内部对照的浓度必须相对较低，从而即使在例如略微抑制的情况中，没有检测出定性内部对照，并且因此该测试是无效的。

在另一方面并且在仅检测样品中微生物核酸的存在或缺乏外，测定所述核酸的量也经常是重要的。举例而言，病毒性疾病的阶段和严重性可以基于病毒载量评估。此外，任何疗法的监测需要关于个体中存在的病原体量的信息以估计疗法的成功与否。对于定量测定法，必需引入定量标准核酸，其充当用于测定微生物核酸的绝对量的参照物。可以通过参照外部校准物或通过执行内部定量标准品来实行定量。

在外部校准物的情况中，使用已知量的相同或相当的核酸在分开的反应中创建标准曲线。然后，通过比较用分析样品获得的结果与所述标准函数来确定微生物核酸的绝对量。然而，外部校准具有的缺点在于，可能的提取规程、其变化的效力、和抑制扩增和/或检测反应的媒介物的可能的且经常不可预测的存在在对照中没有得到反映。

此情况适用于任何样品相关效应。因此，可能的情况是，样品由于不成功的提取规程或其它基于样品的因素而判断为呈阴性，而要检测并量化的微生物核酸实际上存在于该样品中。

出于这些和其它原因，向测试反应自身添加的内部定量标准品具有优点。内部定量标准品在定量测试中至少具有下列两项功能：

i)其监测反应的有效性。

ii)其在滴度计算中充当参照物，如此补偿抑制效应，并且控制制备和扩增过程以容许更准确的定量。因此，与定性测试中仅必须在靶物阴性反应中呈阳性的定性内部对照核酸形成对比，定量测试中的定量标准核酸具有两项功能：反应控制和反应校准。因此，它在靶物阴性和靶物阳性反应中都必须呈阳性且是有效的。

此外，它必须适合于为高核酸浓度的计算提供可靠的参照值。因此，内部定量标准核酸的浓度需要是相对较高的。

定性内部对照核酸和/或内部定量标准核酸可以是竞争性、非竞争性或部分竞争性的。竞争性定性内部对照核酸和/或内部定量标准核酸携带与靶物基本上相同的引物结合位点，并且如此与靶物竞争相同引物。竞争性设置的优点之一是例如必须在测定法中引入的不同引物组较少，如此降低其成本和总体复杂性。此外，监测引物的功能性，亦监测靶物引物特异性的抑制效应。非竞争性定性内部对照核酸和/或内部定量标准核酸与靶物具有不同引物结合位点，并且如此结合不同引物。这类设置的优点包含如下的事实，即反应混合物中不同核酸的单一扩增事件可以在没有任何竞争效应的情况中彼此独立发生，等等。在使用部分竞争性内部定量标准核酸的PCR中，相应的对照核酸和至少一种靶核酸竞争相同引物，而至少一种其它靶核酸结合不同引物。