[发明专利]一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种检测细胞中碱性磷酸酶活力的方法，尤其涉及一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用。

背景技术

骨质疏松即骨质疏松症，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。骨的生成与吸收是一个动态平衡，由成骨细胞介导的骨生成和破骨细胞接到的骨吸收两个过程动态的调控。当骨吸收速度超过骨形成时，会出现骨量减少，发生骨质疏松症。碱性磷酸酶的活性常作为骨代谢的标志物，由于碱性磷酸酶的功能与成骨过程密切相关，故而碱性磷酸酶活性属于特征性的骨形成代谢指标。

利用碱性磷酸酶可以在碱性环境中催化底物产生显色或荧光反应，从而可以量化检测不同样本中碱性磷酸酶的活性。现有技术主要通过改进显色底物从而提高碱性磷酸酶活力检测的灵敏度。如公布号为CN1322255的碱性磷酸酶检测方法用450nm左右的检测波长进行测定并提出了消减血红蛋白干扰的方法。又如公布号为CN103645185A的方法，将酶促金属化和纳米金诱导银沉积相结合，提高了检测碱性磷酸酶的灵敏度。而公布号为CN104109176A的专利申请，则将荧光探针应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测，其精确度和灵敏度都有很大的提高。

但是在药物实验中比如药物筛选实验中，不同浓度药物溶剂或者助剂对细胞生长进行干预的情况下，往往导致药物干预后细胞发生部分的失活、凋亡或者死亡，导致每个样本的细胞数量改变，进而每个样本的碱性磷酸酶活性变化不能准确表现药物对单位细胞中碱性磷酸酶活性的影响。常规细胞活力检测方法为显色反应（如MTT法或CCK8法），但是由于碱性磷酸酶的活力检测通常依赖于显色反应进行标定，这些常规的方法不适合细胞中碱性磷酸酶活性检测，会干扰实验的准确性。而现有技术对碱性磷酸酶活性检测，均未考虑药物或药物溶剂的毒性度细胞本身的影响，这些方法尚不适用于药物筛选。

发明内容

所要解决的问题：针对以上问题，本发明提供能够同时检测细胞碱性磷酸酶活力并且量化细胞活力的检测方法，有效避免药物实验不同浓度药物溶剂或者助剂对细胞产生的影响，增加药物试验的可靠性，且本方法成本低，效率高。

技术方案

一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，包括以下步骤：

A、对培养的细胞进行基因工程修饰，导入非分泌型萤光素酶报告基因；

B、转染细胞细胞后冷冻保存备用或移入容器中；

C、加入药物干预

D、吸弃培养液并洗涤，加入细胞裂解液裂解细胞，得到细胞裂解液；

E、检测：取部分细胞裂解液加入含有萤光素酶发光底物的溶液得到样品，检测样品得到发光度值RLU；另取部分细胞裂解物或直接向发光检测后的样品中，加入碱性磷酸酶显色底物溶液，以空白裂解液校正检测产物吸光度；以分解产物为标准品溶液计算的标准曲线，标定样品分解产物产生量，为A；上述检测步骤均以空白裂解液位参比样品；

F、根据得到的RLU与 A比值，计算最终萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性Q值，公式为Q=A/RLU。

常见的碱性磷酸显色底物中含有对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)，其分解产物为对硝基酚(p-nitrophenol ,p-NP)。

更进一步的，所述的非分泌萤光素酶报告基因为海肾萤光素酶报告基因、萤火虫萤光素酶报告基因、细菌萤光素酶基因；所述的A步骤处理细胞为成骨细胞系、原代成骨细胞。

更进一步的，所述的非分泌萤光素酶报告基因为海肾萤光素酶报告基因；所述的成骨细胞为成骨细胞系MC3T3-E1或ROS 17/2.8细胞。

更进一步的，所述的A步骤中，萤光素酶报告基因载体为细菌质粒，所述的载体启动子为CMV、SV40。

更进一步的，所述的B步骤中，设有转染后再培养扩增细胞步骤。

更进一步的，B步骤中所述的容器为加样板。

更进一步的，步骤E中所述的发光底物为腔肠素、甲虫荧光素或还原型黄素单核苷酸；

其中，所述的因为海肾萤光素酶报告基因对应发光底物为腔肠素（Coelenterazine）；所述的萤火虫萤光素酶报告基因对应发光底物为甲虫荧光素（Luciferin）；所述细菌萤光素酶基因的对应发光底物为还原型黄素单核苷酸（FMNH₂）

以上报告基因与发光底物在非分泌型萤光素酶为唯一对应关系。