[发明专利]一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用

权利要求书

1.一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

A、对培养的细胞进行基因工程修饰，导入非分泌型萤光素酶报告基因；

B、加入药物干预

C、吸弃培养液并洗涤，加入细胞裂解液裂解细胞，得到细胞裂解液；

D、检测：取部分细胞裂解液加入含有萤光素酶发光底物的溶液得到样品，检测样品得到发光度值RLU；另取部分细胞裂解物或直接向发光检测后的样品中，加入碱性磷酸酶显色底物溶液，以空白裂解液校正检测产物吸光度；以分解产物为标准品溶液计算的标准曲线，标定样品分解产物产生量，为A；上述检测步骤均以空白裂解液位参比样品；

E、根据得到的RLU与 A比值，计算最终萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性Q值，公式为Q=A/RLU。

2.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用,其特征在于，所述的非分泌萤光素酶报告基因为海肾萤光素酶报告基因、萤火虫萤光素酶报告基因、细菌萤光素酶基因；所述的A步骤处理细胞为成骨细胞系、原代成骨细胞。

3.根据权利要求2所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法，其特征在于，所述的非分泌萤光素酶报告基因为海肾萤光素酶报告基因；所述的成骨细胞为成骨细胞系MC3T3-E1或ROS 17/2.8细胞。

4.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征在于，所述的A步骤中，萤光素酶报告基因载体为细菌或病毒质粒，所述的载体启动子为CMV、SV40。

5.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征在于，所述的A步骤后，可以设有转染后再培养扩增细胞并筛选纯化的步骤。

6.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征在于，A步骤中所述的容器为加样板。

7.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征在于，步骤D中所述的发光底物为腔肠素、甲虫荧光素或还原型黄素单核苷酸；

所述的碱性磷酸酶显色底物溶液为含有对硝基苯磷酸酯的溶液；所述的分解产物为对硝基酚；所述的E中使用细胞裂解液为壬基酚聚氧乙烯醚、 曲拉通 X-100、 吐温-20、洋地黄皂苷或皂素表面活性剂水溶液。

8.根据权利要求1或7中所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征在于，所述的细胞裂解液组成为：1%曲拉通X-100,1mM乙二胺四乙酸, 5mM 氯化镁, 5% 甘油, 25mM Tris-HCl缓冲液 pH7.4，溶剂为超纯水；

所述的海肾萤光素酶发光底物溶液组成为：腔肠素 2.5uM, 氯化钠 1.1 M, 磷酸二氢钾 0.22M, pH 5.0，溶剂为超纯水；

所述的萤火虫萤光素酶发光底物溶液组成为：25 mM双甘氨肽, pH 为8.0 的15 mM磷酸二氢钾, 4 mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸, 2 mM三磷酸腺苷, 1 mM二硫代苏糖醇, 15 mM 硫酸镁, 0.1 mM 辅酶A, 75 uM甲虫荧光素，溶剂为超纯水。

9.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征在于，所述的检测碱性磷酸酶活性吸光度检测条件为400-415nm检测吸光度,所述的检测条件为405nm；所述的检测萤光素酶吸光度检测条件为加入萤光素酶发光底物溶液,彻底混匀后10分钟内检测，检测时间为10秒；条件为在21℃条件下逐孔加入，流速200ul/s，旋转震荡5s，旋转半径6mm，频率250rpmm，间隔5s，随后对该孔检测发光度10s。

10.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征在于，应用于抗骨质疏松药物筛选实验。