[发明专利]一种利用病毒RNA表达机制进行条件表达筛选、清除被病毒感染的细胞的方法

说明书

本发明属于生物回路的设计及使用方法领域，具体涉及一种利用病毒RNA表达机制进行条件表达筛选、清除被病毒感染的细胞的方法。现有实验室中对感染病毒的细胞进行标记的方法需要对病毒进行基因重组或标记，本发明方法可以实现在不对病毒进行基因改造和标记的条件下实现对被某些野生型病毒感染的细胞的筛选；本发明利用病毒基因组复制表达机制令被病毒感染的细胞表达特定基因，应用此方法，可以在细胞群中特异性的使被病毒感染的细胞表达外源基因，并且不会影响细胞群中其他正常细胞的生命活动；本发明还通过设置不同的外源基因来实现不同的功能，例如可以设置荧光蛋白基因使被病毒感染的细胞显色，设置死亡基因来清除被病毒感染的细胞，表达出改造的病毒蛋白干扰病毒复制等。

技术领域

本发明属于生物回路的设计及使用方法领域，具体涉及一种利用病毒RNA表达机制进行条件表达筛选、清除被病毒感染的细胞的方法。

背景技术

现有技术主要通过在病毒基因组中插入荧光蛋白基因来实现肉眼可见的病毒侵染过程观测。但是这种方式需要对病毒的基因组进行编辑，操作难度较大且一次编辑只能用来观察一种特定的病毒。而病毒的筛选过程，现有技术方法主要通过病毒表面蛋白实现对病毒的筛选，但病毒膜蛋白易变异，原有筛选制剂在病毒发生变异后便会失效。

目前，已有开发了大量的抗病毒药物，大多数抗病毒药物针对的是病毒本身或者病毒复制进程的某一步过程，虽然针对性强，但同时对病毒的快速变异缺乏快速反应，耐药性较差。

发明内容

本发明针对现有实验室中对感染病毒的细胞进行筛选的过程中，需要对病毒进行基因重组或标记，本发明提供一种可以实现在不对病毒进行基因改造和标记的条件下实现对被某些野生型病毒感染的细胞的筛选。

本发明还提供了一种利用病毒基因组复制表达机制令被病毒感染的细胞表达特定基因的方法，应用此方法，可以在细胞群中特异性的使被病毒感染的细胞表达外源基因，并且不会影响细胞群中其他正常细胞的生命活动。

本发明还通过设置不同的外源基因来实现不同的功能。比如可以设置荧光蛋白基因使被病毒感染的细胞显色，设置死亡基因来清除被病毒感染的细胞，表达出改造的病毒蛋白干扰病毒复制等。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用病毒RNA表达机制进行条件表达筛选或清除被病毒感染细胞的方法，包括如下步骤：

(1)获取病毒RNA序列；可以通过现有技术实现，如直接从基因文库中获取、对RNA病毒进行RNA测序等；

(2)设计负链RNA：根据步骤(1)获得的病毒RNA序列，设计一个模仿病毒RNA与病毒核酸酶相互作用的负链RNA；此负链RNA上带有用来进行筛选或者用来进行杀伤细胞的外源基因的互补序列，并且此负链RNA链可以利用病毒RNA复制机制产生互补的正链RNA或者亚基因组mRNA；

(3)导入设计的负链RNA：将步骤(2)设计的负链RNA导入到细胞中，使细胞中存在步骤(2)设计的RNA，负链RNA和其模仿的RNA病毒应在细胞中处于相同的位置，如同时处在细胞质或细胞核中；一般的RNA病毒在细胞质中进行RNA复制，负链RNA导入到细胞的过程中可以使用对应病毒的改造缺陷病毒、其它病毒或者脂质体等作为载体，也可以使用重组痘病毒进行间接转入，即利用痘病毒自身转录机制将设计的RNA从痘病毒DNA中转录导入细胞；对于需要在细胞核中进行RNA复制的病毒(如甲型流感病毒)，负链RNA导入到细胞的过程中可以采用缺陷流感病毒作为载体；

(4)条件表达RNA激活，产生可翻译的正链RNA：在设计的负链RNA被成功导入细胞指定位置并且在此负链RNA没有被细胞降解之前，如果病毒成功感染细胞并在细胞内复制表达，那么设计的负链RNA便可以利用病毒RNA与其核酸酶的作用机制进行转录和RNA复制，产生全基因组正链RNA序列或亚基因组mRNA序列；