[发明专利]一种利用病毒RNA表达机制进行条件表达筛选、清除被病毒感染的细胞的方法在审
| 申请号： | 201710183811.3 | 申请日： | 2017-03-24 |
| 公开（公告）号： | CN108624648A | 公开（公告）日： | 2018-10-09 |
| 发明（设计）人： | 王佳坤 | 申请（专利权）人： | 王佳坤 |
| 主分类号： | C12Q1/02 | 分类号： | C12Q1/02;G01N21/64 |
| 代理公司： | 湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102 | 代理人： | 徐晓琴 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 病毒感染 细胞 外源基因 细胞表达 病毒RNA 病毒 筛选 野生型病毒感染 荧光蛋白基因 病毒基因组 病毒蛋白 病毒复制 基因改造 基因重组 生命活动 死亡基因 影响细胞 正常细胞 细胞群 显色 复制 感染 基因 应用 改造 | ||
1.一种利用病毒RNA表达机制进行条件表达筛选或清除被病毒感染细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获取病毒RNA序列；
(2)设计负链RNA：根据步骤(1)获得的病毒RNA序列，设计一个模仿病毒RNA与病毒核酸酶相互作用的负链RNA；所述负链RNA上带有用来进行筛选或者用来进行杀伤细胞的外源基因的互补序列，并且所述负链RNA链可以利用病毒RNA复制机制产生互补的正链RNA或者亚基因组mRNA；
(3)导入设计的负链RNA：将步骤(2)设计的负链RNA导入到细胞内，使细胞中存在负链RNA，负链RNA和其模仿的RNA病毒应在细胞中处于相同的位置；
(4)条件表达RNA激活，产生可翻译的正链RNA：在设计的负链RNA被成功导入细胞指定位置并且在此负链RNA没有被细胞降解之前，如果病毒成功感染细胞并在细胞内复制表达，那么设计的负链RNA便可以利用病毒RNA与核酸酶的作用机制进行转录和RNA复制，产生全基因组正链RNA序列或亚基因组mRNA序列；
(5)条件表达RNA的复制：步骤(4)产生的全基因组正链RNA序列或亚基因组mRNA序列模仿病毒进行复制；
(6)翻译：全基因组正链RNA序列或亚基因组mRNA在病毒控制的细胞翻译进程下和病毒的基因一起被翻译，不受病毒对细胞正常翻译抑制的影响；
(7)细胞筛选：根据翻译出的外源蛋白质，筛选出被病毒感染的细胞；或者
细胞清除：外源基因为对细胞有杀伤作用的死亡基因，则翻译出的外源蛋白质可以将细胞杀死并终结细胞中正在进行的病毒增殖进程。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因为荧光蛋白基因，翻译出的外源蛋白质为荧光蛋白，进行细胞筛选时可通过荧光显色反应筛选出被病毒感染的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述负链RNA和其模仿的RNA病毒均处在细胞质中，负链RNA导入到细胞的过程中使用对应病毒的改造缺陷病毒、其它病毒或者脂质体作为载体；所述负链RNA和其模仿的RNA病毒均处在细胞核中，负链RNA导入到细胞的过程中采用缺陷流感病毒作为载体。
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