[发明专利]一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程制药领域，涉及一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用，具体涉及一种酵母偏好密码子编码的促血小板生成素模拟肽(Thrombopoietin Mimetic Peptide，TMP)二联体与人血清白蛋白分子(Human serum Albumin，HSA)的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋包含一个HSA分子和一个酵母偏好密码子编码的TMP二联体，其中，HSA分子位于融合蛋白的N‑末端，酵母偏好密码子编码的TMP二联体位于融合蛋白的C‑末端。所述融合蛋白能在酵母体内高水平的稳定表达，可应用于工业生产；同时，该融合蛋白具有显著促进血小板生成的特性，在人体内具有较长的半衰期，可用于制备治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病的药物。

技术领域

本发明属于基因工程制药领域，涉及一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用，具体涉及一种酵母偏好密码子编码的促血小板生成素模拟肽(ThrombopoietinMimetic Peptide，TMP)二联体与人血清白蛋白分子(Human serum Albumin，HSA)的融合蛋白。

背景技术

在临床上常会遇到由各种原因引起的原发性和继发性血小板减少症，如原发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血以及肿瘤化/放疗造成的血小板减少等。对于这类疾病，比较适合应用长效升血小板药物进行救治，一方面，可以减少用药次数，减少病人的针痛之苦；另一方面，可以减少药物用量，降低治疗费用。

血小板由巨核细胞产生，促进巨核细胞的增殖、分化是提高血小板水平的主要手段。促血小板生成素(Thrombopoietin，TMP)，又称巨核细胞生长发育因子(MGDF)，是骨髓巨核细胞增殖、分化和血小板生成的最重要调控因子。1994年TMP基因缺少注释被首次成功克隆后不久，人们即研制出一种聚乙二醇(PEG)化的重组功能型TMP基因工程产品-PEG-rHuMGDF。动物实验结果表明，PEG-rHuMGDF不仅具有突出的促血小板生成活性，而且在体内具有较长的半衰期，单次应用即可达到显著升高血小板的效果。然而，在临床试验过程中人们发现，一些健康受试者在接受该药物治疗后所产生的抗体与内源性TMP存在交差中和反应，导致受试者出现血小板减少，从而使得PEG-rHuMGDF乃至重组人TMP的研制在1998年时即被美国FDA叫停。受其影响，在美、欧、日本等国家至今重组人TMP都未被批准进入临床。

人血清白蛋白分子(Albumin Human，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，约占血浆总蛋白的50-60％。HSA分子是一种非糖基化单链蛋白，共由585个氨基酸残基组成，其分子量为66.5kDa(A.Dugaiczyk et al.，PNAS，1982，79：71-75)，血浆半衰期长达两周以上。HSA分子在宿主细胞中是以一种原肽形式合成的，其中含24个氨基酸残基组成的信号肽和前肽，在转运和分泌过程中信号肽和前肽被切除。HSA分子是一个稳定的惰性蛋白，可以作为药物载体。HSA分子以下同已成功地在多宿主中表达(EP330451和EP361991)，尤其在酵母细胞中可实现HSA分子较高水平的稳定表达。当目的多肽与HSA分子融合表达时不仅可以提高多肽药物的稳定性，还可以增加多肽药物在体内的半衰期。专利号CN201310084212.8的二聚体化融合蛋白的制备及应用中公开了二聚体化促血小板生成素(TPO)模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白分子融合蛋白的制备及应用，但是其存在融合蛋白表达效果不理想的问题，为了提高表达产量、增强融合蛋白的生物活性，本发明采用了酵母偏好密码子编码促血小板生成素模拟肽TMP二联体的策略。基于上述研究现状，本发明现提供一种促血小板生成素的融合蛋白，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由酵母偏好密码子编码而成的，所述融合蛋白能在酵母体内高水平的稳定表达，可应用于工业生产；同时，该融合蛋白具有显著促进血小板生成的特性，在人体内具有较长的半衰期。本发明同时提供该融合蛋白的制备方法和应用。