[发明专利]多重荧光定量PCR的方法

说明书

本发明提供了一种多重荧光定量PCR的方法。该方法包括：将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增，PCR扩增包括N轮热循环，10≤N≤50；每轮热循环后对PCR产物进行程序升温，获得多个目标PCR扩增片段形成的混合片段的熔解曲线；计算每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量，进而建立各单一目标片段的含量随PCR热循环次数增加而变化的扩增曲线；根据扩增曲线计算得到各单一目标片段对应的Ct值，进而根据Ct值计算得到各单一目标片段的起始浓度。该方法能利用单个光学采集通道的数据实现对各目标扩增片段进行准确检测和定量，且不受目标片段数量、多个目标片段的解链温度是否已知或是否接近的限制。

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR领域，具体而言，涉及一种多重荧光定量PCR的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称为PCR)是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术。利用该PCR技术，可以在体外由非常少量的DNA通过热循环生成大量的DNA。PCR技术包括若干个重复的循环，每个循环包括模板的解链、引物与模板的杂交和引物的延伸步骤。

多重PCR通过加入多对引物，来实现单个PCR反应体系中对多个目标片段的扩增。同步的扩增反应减小了实验的成本，缩短了PCR分析的总时间，同时也减小了实验之间的差异，降低了交叉污染的风险，因此在DNA检测领域有着广泛的应用。

传统的PCR和多重PCR仅能对扩增的最终产物进行定量，存在一定的限制。实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System简称为QPCR)是在普通PCR体系中加入荧光化学物质对每次热循环后产物的总量进行测定，其结果可以较快取得且数据较为稳定。通过实时检测样品的荧光强度，可以精确的反推出待测样品中的特定DNA序列的初始浓度。

现有技术中，有些QPCR使用双链DNA染料对扩增产物进行定量。这类染料自身几乎没有荧光，在单链DNA存在的情况下，也没有荧光。只有在与双链DNA结合后，这类染料能产生很强的荧光。然而，这类染料无法识别特定的序列，因此无法对多种扩增产物分别进行定量。为了避免这一缺点，多重QPCR通常使用多个荧光标记的特异性探针。探针能够结合到产物中间的特定序列，并在扩增过程中水解而产生荧光。通过使用荧光标记的特异性探针对特定的扩增产物进行定量，使得多重QPCR成为可能。

尽管如此，基于荧光探针的多重QPCR还是存在一定的限制。首先探针需要标记上不同的荧光染料，仪器也需要具备多个光学检测通道。由于染料的发射光谱特性和仪器光学检测通道的规格，可以相互组合的染料种类和数量存在一定的限制。通道之间的串扰也可能导致检测准确度的下降。此外，合成荧光标记探针、配置一台可以采集多个通道的QPCR仪器，都需要增加不少的经济成本。

因此，需要有一种新的多重荧光定量PCR的方法，以解决现有技术中在单个荧光检测通道下进行多重QPCR时存在的普适性低以及准确度差的问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种多重荧光定量PCR的方法，以解决现有技术中的多重荧光定量PCR方法普适性差及准确度不够的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种多重荧光定量PCR的方法，该方法包括：将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增，PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50；每轮PCR热循环后，对PCR产物进行程序升温，获得多个目标片段形成的混合片段的熔解曲线；根据混合片段的熔解曲线，计算每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量，进而建立各单一目标片段的含量随PCR热循环次数增加而变化的扩增曲线；根据各单一目标片段的扩增曲线计算得到各单一目标片段对应的Ct值，进而根据Ct值计算得到各单一目标片段的起始浓度。

进一步地，通过对混合片段的熔解曲线进行拟合的方式，计算每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量。