[发明专利]多重荧光定量PCR的方法

权利要求书

1.一种多重荧光定量PCR的方法，其特征在于，所述方法包括：

将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增，所述PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50，且所述同一扩增体系中包括双链DNA染料；

每一轮PCR热循环后，对PCR产物进行程序升温；

在对所述PCR产物进行程序升温的过程中，对所述PCR产物的荧光强度进行采集，从而获得所述多个目标片段形成的混合片段的熔解曲线；

建立各单一目标片段的熔解曲线，利用公式(1)对各所述单一目标片段的熔解曲线进行拟合；

将各所述单一目标产物的熔解曲线的拟合公式进行叠加，得到所述公式(2)；

在所述公式(1)中，x表示温度，y表示观测到的相对荧光强度，参数a表示对应的单一目标片段的含量所对应的荧光强度，参数b表示对应的单一目标片段产物的荧光强度随温度线性变化的系数，参数c表征对应的单一目标片段在温度为Tm±5℃范围内荧光强度的下降速率，参数d表示背景荧光强度，参数Tm表示对应的单一目标片段的熔解温度，e为自然常数；

在所述公式(2)中，x表示温度，y表示观测到的相对荧光强度，n表示目标片段的数量，n为≥2的整数，i为自然数，参数a_i表示第i个的目标片段的含量所对应的荧光强度，参数b_i表示第i个目标片段的荧光强度随温度线性变化的系数，参数c_i表征第i个目标片段在温度为Tm_i±5℃范围内荧光强度的下降速率，参数d表示背景荧光强度，参数Tm_i表示第i个目标片段的熔解温度，e为自然常数；

利用公式(2)对所述混合片段的熔解曲线进行拟合的方式，计算所述每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量，进而建立各单一目标片段的含量随PCR热循环次数增加而变化的扩增曲线；

根据各单一目标片段的扩增曲线计算得到各单一目标片段对应的Ct值，进而根据所述Ct值计算得到各单一目标片段的起始浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述程序升温是按照0.5～10℃/s的升温速率从起点温度升至终点温度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述起点温度为40～90℃，所述终点温度为60～100℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述PCR产物的荧光产物进行采集的速率为0.2～100点/秒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，建立各单一目标片段的熔解曲线的步骤包括：利用各单一目标片段对应的单一引物对进行PCR扩增，所述PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50，其中，每一轮PCR热循环的步骤包括：85～100℃的解链以及解链之后的40～75℃的延伸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在最后一轮PCR热循环后，采集各单一目标片段的PCR产物的荧光强度，建立各所述单一目标片段的熔解曲线。