[发明专利]CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒

说明书

本发明提供CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒，涉及生物大分子检测领域。所述方法包括：第一步：提取待测样品DNA；第二步：PCR反应：取特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶，加入待测样品DNA配成PCR反应液；第三步：进行PCR扩增反应，于每个循环结束时测定吸光值；第二步中所述特异性扩增引物为：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明提供能够有效的追踪人体内或培养过程中CD22三代嵌合抗原受体含量，提示治疗情况并为治疗剂量提供参考，效果准确迅速。

技术领域

本发明涉及生物大分子检测领域，更具体地说，涉及CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

嵌合抗原受体（CAR）是单链抗体的可变区和T细胞信号分子的融合蛋白，它使T细胞可以通过非MHC 限制性的方式识别特异性抗原，发挥杀伤作用。目前，CAR的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信号结构域（第二、三代），在体内的存在时间及杀伤能力明显增强。利用靶向 CD19和CD20的CAR修饰的T细胞进行过继输注，治疗血液系统恶性肿瘤是目前临床研究的热点。由于CAR-T 细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁；多靶向更精准。CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围，CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制;杀瘤范围更广。CAR技术也正研究用于骨髓移植后的过继免疫治疗等领域。在治疗安全性方面，目前临床试验中大部分患者对CAR治疗耐受性良好。目前大部分的CRA-T技术都处于研发状态，因为细胞毒性和脱靶问题的存在给治疗带来不确定性，所以实时监控检测治疗过程中人体内基因表达水平显得尤为重要。

实时定量PCR检测方法(real-time PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。实时定量PCR在常规PCR基础上把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，能提高灵敏度，且在整个实验中，所有反应物在同一溶液中进行，不需要任何后处理过程，被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关。

随着自体细胞回输技术的不断成熟与完善，对CD22三代嵌合抗原受体的含量检测要求更加精准，CD22三代嵌合抗原受体含量直接关系是否能够产生疗效。目前没有一种针对CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒，该方法能够有效的追踪人体内或培养过程中CD22三代嵌合抗原受体含量，提示治疗情况并为治疗剂量提供参考，效果准确迅速。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法，所述方法包括：

第一步：提取待测样品DNA；

第二步：PCR反应：取特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶，加入待测样品DNA配成PCR反应液；

第三步：进行PCR扩增反应，于每个循环结束时测定吸光值；

第二步中所述特异性扩增引物为：

上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。