[发明专利]一种丹参种质资源鉴定方法

说明书

本发明涉及一种利用基于丹参转录组序列开发SSR引物标记丹参种质资源的快速鉴定方法，主要包括以下步骤：（1）野外采集野生丹参样品，提取待测所有丹参群体基因组DNA，并检测提取质量；（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，用基于丹参转录组序列的SSR引物组合进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行测序分型和基因片段长度读取；（4）利用遗传学分析软件建立丹参的SSR遗传信息特征库和种质资源鉴定框架，并进行有效性验证。该方法能够对来自全国不同地区的野生丹参群体进行有效、快速的分类和鉴定，结果准确可靠，同时，该方法简便易行，且适用性高、可重复性强，可有效运用于丹参的种质资源鉴定。

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及植物种质资源鉴定中SSR引物的开发和应用。通过转录组测序的方法，高效开发了40对特异性强、多态性高的SSR引物，以我国12个省份的野生丹参资源为材料，覆盖中药材丹参自然分布区与主产区，建立了我国野生丹参的SSR遗传信息特征库和丹参种质资源鉴定框架，提供了一种种质资源快速鉴定的方法。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为中国传统大宗药材之一，自然群体在我国广泛分布，为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，其药用部位为根或根茎，有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈等功效，其根部提取物有效成分为水溶性成分如酚酸类和脂溶性成分如丹参酮类成分，经临床试验表明，在治疗心血管疾病、肾功能衰竭、改善肝功能和预防脏器纤维化等方面有显著疗效。目前，市场上的丹参药材多为栽培品种，由于长期栽培，致使各栽培品种基因多样性降低，优良性状逐渐丧失，药材质量衰退。因此，亟需对野生丹参资源进行开发利用，这需要通过一种丹参种质资源的分子鉴定方法来评估全国各地产丹参的遗传资源状况，为丹参的分子育种奠定基础。同时，由于近年来市场对丹参药材的需求量持续增加，不法商贩出于经济利益，以次充好，导致伪品和劣质品横行，而且从形态上难以鉴别，亟需一种科学快速的种源鉴定方法来识别真伪。本发明通过对全国12个省份39个地区的野生丹参的采集，基于转录组数据批量开发了丹参SSR分子标记，通过建立野生丹参的SSR遗传信息特征库和种质资源鉴定框架，进行大量试验后，发明了一种丹参种质资源快速鉴定的方法，这将对丹参种质资源的真伪鉴别、道地性评价、标准化药材生产带来便利，也为丹参资源的合理开发利用奠定基础。

SSR分子标记作为一项方法成熟、操作快捷、结果可靠的技术，已广泛用于植物的种质资源鉴定。尽管目前已有利用SSR标记对丹参进行种质资源鉴定的案例(Xu etal.Biochemical Systematics and Ecology 51(2013)308–313；王学勇等，中国中药杂志，2011，36(3)：289-293)，但无论是SSR标记的来源，还是测试的丹参样品(栽培居群，且未覆盖丹参的分布区)，都不能包涵丹参较为全面的遗传信息，而且实验方案的通用性和资源鉴定的应用性方面存在缺陷。因此，需要开发一种高效鉴定丹参种质资源的方法。现有技术中虽然有针对丹参进行SSR标记进行开发的专利文献(CN101684481)，该文献利用公开数据库中的EST序列设计SSR引物，但样本量不足，分辨率低，不能够对任意种源进行准确的种质资源评价，本发明则利用实验测得转录组数据库设计开发丹参高分辨率SSR分子标记，在技术和实施上都具有一定优势，相比于传统的SSR分子标记开发方法，借助高通量测序技术批量开发SSR引物，可以获得覆盖面更广、遗传多样性更高的位点，可更高效地鉴定物种种质资源。本发明还利用大量实验样本(37个居群，222份植物材料)，获得我国12个省份所产丹参群体丰富的遗传多样性信息，建立丹参种质资源遗传特征信息库和种质资源鉴定框架，可对任意丹参材料进行种质资源鉴定，准确率高。该方法技术成熟、实施流程便捷且鉴定效果明显，将为后续丹参植物资源的科学利用和开发提供基础和便利。

参考文献：