[发明专利]一种穗菝葜的种质资源鉴定方法

说明书

本发明涉及一种利用SSR分子标记快速鉴定穗菝葜种质资源的方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，用基于穗菝葜转录组序列的SSR引物组合进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行测序分型和基因片段长度读取；（4）利用遗传学分析软件建立穗菝葜的SSR遗传信息特征库和种质资源鉴定框架并进行有效性验证。该方法能够对来自欧洲、非洲、亚洲的不同产地，及地区内不同自然群体来源的穗菝葜进行有效、快速的分类和鉴定，结果准确可靠，该方法简单易行，适用性高，可有效运用于穗菝葜的种质资源鉴定。

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及植物种质资源鉴定中引物组的开发和应用，通过转录组测序的方法，高效开发了47对特异性强、灵敏度佳的SSR引物，以欧洲、亚洲、非洲产的穗菝葜植物资源为材料，覆盖其自然分布区，以此建立穗菝葜植物的SSR遗传信息特征库和种质资源鉴定框架，并进行快速种质资源鉴定的方法。

背景技术

穗菝葜(Smilax aspera Linnaeus，英文名Italian sarsaparilla、roughbindweed)为菝葜科菝葜属多年生攀援藤本或小灌木，广布于欧洲地中海地区、非洲东部、亚洲南部地区，我国产于云南(西南部)和西藏(聂拉木、吉隆等地)。经国内外学者研究发现穗菝葜植株各部位具有潜在药用及经济价值：其叶提取物富含维他命E族(α生育酚、β生育酚、γ生育酚)抗氧化物；其浆果提取物富含花青素(矢车菊素-3-O-芦丁糖甙、天竺葵素-3-O-芦丁糖苷)，可作为天然色素良好来源；其根部提取物含有呋甾皂苷、甾体皂苷、菝葜皂苷、白藜芦醇、反式白藜芦醇等成分，有抗炎、抗真菌、抗麻风等活性，具有镇痛、利尿、发汗、滋补、净化等功效；穗菝葜的根部提取物也是生产沙士饮料的原料之一，该类型产品占台湾碳酸饮料市场三成以上。虽然在研究和应用领域越来越受到关注，但由于其分布范围广，横跨欧洲、非洲、亚洲三个大陆，不同地区种质资源在有效成分和遗传物质上存在差异，如能有效甄别穗菝葜的种质资源类型，将给后续植物资源的合理利用和开发带来便利。

SSR分子标记作为一项方法成熟、操作快捷、结果可靠的技术已广泛用于植物的种质资源鉴定。邱杨等(植物遗传资源学报2014，15(3)：648-654)利用SSR分子标记技术对75份不同来源的萝卜样本进行了种质资源鉴定，并建立了分子身份证；王瑞等(中国农学通报2016，32(34)：135-142)利用SSR分子标记技术对南瓜的不同品种进行了种质资源分析，将南瓜分为中国南瓜、印度南瓜及美洲南瓜3个类群。

目前虽然已有报道对穗菝葜进行分子标记开发的案例，但无论是实施方案和可行性方面，都存在不足。Xu等(American Journal of Botany:e64–e66.2011)通过双重抑制法开发了少量穗菝葜SSR引物，但该方法仅获得了两碱基重复单元或两碱基重复组合单元类型的SSR标记，遗传多样性不高，位点覆盖度不足，多态性丰富度低，且仅适用于希腊与意大利的穗菝葜植物群体，不能够有效地鉴定不同种源穗菝葜。此外，该方法开发周期长，一次开发获得引物通量低，单位标记成本相对较高。若通过DNA基因片段对穗菝葜进行鉴定，从其鉴别效率看，该方法不能有效甄别区域内群体间的种质资源，通常标记来自于叶绿体单倍型，只能检测单亲母系遗传的遗传信息，而且 如果对所有基因片段进行测序，其费用高昂，面对大批量样本可实施性不佳。因此，需要开发出一种成本相对低廉，且能快速高效鉴定穗菝葜种质资源的方法。利用转录组数据设计开发的简单重复序列(SSR)在技术和实施上都具有一定优势，相比于传统的SSR分子标记开发方法，借助高通量测序技术批量开发SSR引物，可以获得覆盖面更广、遗传多样性更高的位点，可更高效地鉴定物种种质资源，在已有的开发案例中，Wei et al.(BMC Genomics 2011,12:451)通过对芝麻花组织的转录组测序，批量开发SSR引物，有效用于油用经济作物芝麻的种质资源鉴定。本发明通过利用穗菝葜的转录组信息批量开发SSR引物，从欧洲、亚洲、非洲各地的大量穗菝葜野生群体获取丰富的SSR遗传多样性信息，并建立穗菝葜种质资源SSR遗传信息特征库库和种质资源鉴定框架，并进行快速鉴定，该方法技术成熟、实施流程便捷且鉴定效果明显，将为后续穗菝葜植物资源的科学利用和开发提供便利。