[发明专利]新型全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置及标定方法

说明书

技术领域

本发明属于荧光显微镜成像领域，具体涉及一种新型全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置及标定方法。

背景技术

全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescence microscopy,TIRFM)是近年来新兴的一种光学成像技术，该技术利用全内反射时产生的隐失波来激发荧光分子，以观察荧光标记样品在靠近交界面的极薄区域。由于隐失波场存在能量在轴向上呈指数衰减的特性，使得可观察区域的动态范围通常在200nm以下，有效地控制了激发体积，大大降低了背景光噪声干扰，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高信噪比和对比度。故此项技术目前已广泛应用于细胞膜表面物质的动态观察。

根据隐失波场的特性可知，当入射角越大时，产生的隐失波场的入射深度越浅。故每张全内反射荧光显微镜拍摄得到的二维投影图像中都含有丰富的三维信息。因此，确定出各个入射角对应的入射深度就显得尤为重要。

目前市场上的商业全内反射荧光显微镜无法提供激发光的入射角与TIRF入射深度的对应信息。尽管全内反射荧光显微镜有个理论指数衰减模型，但这只是理想情况中的光学模型，并不适用于实际情况。此外，由于实验条件的差异，不同显微镜的轴向衰减模型也不尽相同。所以，建议一种方便快捷的全内反射荧光显微镜入射深度的系统标定方法就显得尤为重要。

目前，不少研究人员付出过精力来研究标定全内反射荧光显微镜的入射深度，比较常用的两种方法是荧光小珠子法和荧光大珠子法。荧光小珠子标定法的原理图如图1所示，其原理是选取a，b等若干个点放置荧光小珠子，每二者距离25nm。以一定的振镜电压V发射光线，测量得到a，b等处荧光的光强为I(a)和I(b)。将测得光强与荧光小珠子所在位置联立拟合曲线，得到I(z)-z曲线，根据公式(1)可以得到渗透深度d。

其难点在于需要特殊的工具来确保荧光小珠子之间的距离为25nm且需要制作工艺复杂且直径很小的荧光小珠子。

荧光大珠子标定法的原理图如图2所示，其原理是一定入射角下的激发光激发的隐失波场深度一定，当荧光珠子直径足够大，利用拍得的投影图即可推算出真实的入射深度。

这两种方法虽然能得到较好的标定结果，但是需要特殊的荧光珠子或实验工具，且后期还需要进行复杂的图像处理数据拟合等过程，使用方法不太方便。

环状全内反射荧光显微镜利用一个环状光圈形成TIRF图像，它的优势在于减少了干涉条纹，快速多角度成像减少了3D成像以及单角度成像产生的色差。

EPI指的是垂直式荧光显微镜。激发光以近乎垂直交界面的形式入射，使得进入样本区域的荧光强度仍旧非常强，可激发样本上标记出的全部荧光染料。

发明内容

鉴于上述，本发明提供了一种全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置，该装置结构简单、成本低，操作方便灵活。

一种全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置，包括：

载玻片；

方形盖玻片，所述方形盖玻片盖于所述载玻片的上表面上且右侧边对齐布置；

玻璃片，所述玻璃片置于所述载玻片上且左侧边接触并对齐布置，所述玻璃片的下表面支撑于所述方向盖玻片上；

所述玻璃片的下表面均匀地涂布有荧光染料。

所述的玻璃片与载玻片的尺寸相同。

作为优选，所述的玻璃片的尺寸为25mm×75mm，为了克服荧光成像的点扩散效应，玻璃片上的荧光染料的厚度为8～12nm。

作为优选，所述的载玻片为Electron Microscopy Sciences公司生产的规格为25mm×75mm的载玻片。

作为优选，所述的方形盖玻片为FisherBrand公司生产的规格为18mm×18mm厚度为0.17mm的方形盖玻片。

本发明还提供了一种利用上述的标定装置对全内反射荧光显微镜入射深度进行标定的方法，具体步骤为：

(1)将标定装置置于可自由切换入射角的全内反射荧光显微镜的载物台上；

(2)将显微镜可视场区域边界在均匀涂有荧光染料的玻璃片的相应位置设为B点，将B点距离载玻片的距离定为z₀；

(3)选择显微镜可视场区域范围内的任一一点作为标定的荧光目标点A，则荧光目标点A的实际深度Z_A可表示为：

z_A＝z₀+xtanα