[发明专利]新型全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置及标定方法

权利要求书

1.一种全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置，其特征在于：

载玻片；

方形盖玻片，所述方形盖玻片盖于所述载玻片的上表面上且右侧边对齐布置；

玻璃片，所述玻璃片置于所述载玻片上且左侧边接触并对齐布置，所述玻璃片的下表面支撑于所述方向盖玻片上；

所述玻璃片的下表面均匀地涂布有荧光染料。

2.根据权利要求1所述全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置，其特征在于：所述的荧光染料的厚度为8～12nm。

3.根据权利要求2所述全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置，其特征在于：所述的玻璃片与载玻片的尺寸相同。

4.一种利用权利要求1～3任一所述的标定装置对全内反射荧光显微镜入射深度进行标定的方法，具体步骤为：

(1)将标定装置置于可自由切换入射角的全内反射荧光显微镜的载物台上；

(2)将显微镜可视场区域边界在均匀涂有荧光染料的玻璃片的相应位置设为B点，将B点距离载玻片的距离定为z₀；

(3)选择显微镜可视场区域范围内的任一一点作为标定的荧光目标点A，则荧光目标点A的实际深度Z_A可表示为：

z_A＝z₀+x tanα

其中，x为荧光目标点A与可视场区域边界之间的距离，α为均匀涂有荧光染料的玻璃片与载玻片之间的夹角；

(4)固定可视场区域，改变显微镜激发光的入射角θ_i，得到该入射角下的TIRFM图像，进而得到荧光目标点A在TIRFM图像的强度I_A(TIRFM)(θ_i)；

(5)改变显微镜激发光垂直射入，得到EPI图像，进而得到荧光目标点A在EPI图像的强度I_A(EPI)，则荧光目标点A在TIRFM图像和EPI图像中的强度比的对数值表示为：

其中，I_A(0,θ_i)表示在激发光的入射角为θ_i时隐失波场在两种折射率的交界面处的光强，d_p(θ_i)表示激发光的入射角为θ_i时的隐失波场的渗透深度，e约为2.718；

(6)选取一列不同的荧光目标点，通过步骤(4)与步骤(5)的方法获得每个荧光目标点在强度TIRFM图像和EPI图像中的强度比的对数值，再对所有荧光目标点在强度TIRFM图像和EPI图像中的强度比的对数值进行线性拟合，得到拟合直线的斜率的负倒数为入射角θ_i对应的渗透深度d_p(θ_i)。