[发明专利]一种荧光定量PCR检测鉴定比萨茶蜗牛的方法

说明书

本发明提供了一种荧光定量PCR检测鉴定比萨茶蜗牛的方法，应用特异性引物及探针对比萨茶蜗牛的分子特征进行识别，其荧光定量PCR反应的上游引物为TPF：5’‑GCTGGAAAGTGGAGGCCGTA‑3’，下游引物为TPR：5’‑GCGGCGTCGGTTAAGAGAGA‑3’，荧光探针为TPP：5’‑FAM‑AGCTGTTCCGGGCACCAAGACGTCACG‑BHQ‑3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ。本发明方法能够快速、准确地检测鉴定比萨茶蜗牛，不仅具有特异性强、灵敏度高、耗时短、结果判定准确方便的优点，而且无需PCR后处理，能有效避免假阳性和交叉污染。

技术领域

本发明涉及一种荧光定量PCR检测鉴定比萨茶蜗牛的方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境口岸检疫及农业生产上比萨茶蜗牛的快速检测鉴定。

背景技术

比萨茶蜗牛Theba pisana 属于柄眼目Stylommatopgora，大蜗牛科Helicidae，茶蜗牛属Theba，是我国新颁布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中的成员。该蜗牛具有树栖习性，抗干旱能力强，极易在林区、果园等新区建立种群，严重危害农林作物和园艺作物，而且蜗牛爬行过后留下的银白色黏液痕迹也可严重降低作物的商品价值。比萨茶蜗牛贝壳与地中海白蜗牛Cernuella virgata等极为相似，往往难以区分，卵粒和幼螺的鉴定则更为困难。由于历史的原因，目前国境口岸的植物检疫人员绝大多数为植物保护专业，对陆生软体动物的分类知之甚少，这种局面给我国的实际检疫工作造成了被动，也是世界各国检验检疫部门共同面临的技术难题。最近二十多年来，分子生物学技术飞速发展，20世纪90年代出现的荧光定量PCR技术在反应体系中加入荧光染料，通过荧光信号的传递来反映DNA扩增量，实现了快而准的检测鉴定。迄今为止，尚未见用于比萨茶蜗牛检测鉴定的荧光定量PCR技术。如果能设计出特异性引物及探针用荧光定量PCR扩增方法为比萨茶蜗牛的快速准确鉴定提供新的技术手段，这个难题就迎刃而解。本发明建立了一种荧光定量PCR方法检测鉴定比萨茶蜗牛的技术，以适应当前国境口岸检疫工作的需要。

发明内容

本发明针对传统形态学和普通PCR鉴定技术所存在的不足开展研究，旨在提供一种准确性好、灵敏度高、特异性强的检测方法，应用于比萨茶蜗牛的快速检测鉴定。

本发明提供了一种荧光定量PCR检测鉴定比萨茶蜗牛的方法，所述方法是应用特异性引物及探针对比萨茶蜗牛的分子特征进行识别，所述引物及探针为：

上游引物为TPF：5’- GCTGGAAAGTGGAGGCCGTA -3’，

下游引物为TPR：5’- GCGGCGTCGGTTAAGAGAGA-3’，

荧光探针为TPP：5’-FAM-AGCTGTTCCGGGCACCAAGACGTCACG-BHQ-3’， 5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ，

以上引物及探针浓度均为10μmol/L。

本发明的荧光定量PCR反应体系总体积为25μL，其中2×TaqMan PCR Master Mix12.5μL，上、下游引物及探针各1μL，DNA模板2μL，余下用灭菌ddH₂O补足。

所述荧光定量PCR反应的程序为：95℃预变性5min；95℃ 10s，60℃ 34s，40个循环；结束反应。

本发明的显著优点：本发明方法能够快速、准确地检测鉴定比萨茶蜗牛。本发明为植物检疫中对检疫性有害生物比萨茶蜗牛的检测鉴定提供了新的技术手段，对于防止比萨茶蜗牛的传入和扩散具有重要意义。

本发明所提供的一种荧光定量PCR检测鉴定比萨茶蜗牛的方法具有以下有益效果：