[发明专利]一组甲基化基因及其检测方法

权利要求书

1.一种一组甲基化基因，其特征在于，所述一组甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分别为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。

2.一种如权利要求1所述一组甲基化基因的检测方法，其特征在于，所述一组甲基化基因的检测方法包括以下步骤：

1)抽取受检者外周血20ml，并将其血浆分离；提取上述血浆中的cfDNA,并对其进行亚硫酸盐修饰；

2)分别设计p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，对上述亚硫酸盐修饰过的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因进行巢氏甲基化特异性PCR两轮扩增；

3)将上述PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察结果，并行测序验证；

4)对上述观察结果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情况进行联合检测评估。

3.如权利要求2所述的一组甲基化基因的检测方法，其特征在于，所述一组甲基化基因的检测方法具体包括：

步骤一，血浆样本的分离及保存：抽取受检者外周血20ml，并立即置于4℃冰箱短时间保存1h，备用；把分别装有10ml左右外周血样本的两只抗凝管置于低速离心机，然后2500rpm，4℃离心，15min，使样品分血浆、白细胞、红细胞三层；用移液枪小心轻柔的吸出抗凝管中最上层2/3的血浆，置于新的15ml离心管中；然后把取出的血浆再次2500rpm，4℃离心，10min；并把上清液分装到几管1.5ml离心管中，标记好后置于-80℃保存；

步骤二，血浆cfDNA的提取及其浓度测定；

步骤三：cfDNA的琼脂糖凝胶电泳：制备1％的琼脂糖凝胶；并且等琼脂糖溶液温度降至65℃时加入花青素；制备胶板；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入制胶槽内，室温下静置，直至完全凝固；将凝固后的胶板放入已倒入1×TAE缓冲液的电泳槽中浸润，然后开始点样；取4μl血浆cfDNA与2μl的6×loading Dye混合，然后依据样品顺序逐孔点样；在100V电压下电泳20分钟，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下观察结果；

步骤四，血浆cfDNA的亚硫酸氢盐修饰；

步骤五，血浆cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特异性PCR扩增；

步骤六：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；

步骤七：判断标准:把只有单独的甲基化M引物扩增成功或者是甲基化M引物及非甲基化U引物都扩增成功判断为此基因有阳性异常甲基化，而把只有单独的非甲基化引物U扩增成功判断为此基因阴性无异常甲基化；M代表甲基化，U代表非甲基化；

步骤八：PCR结果的验证，包括：

(1)PCR产物的选取：取出p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血浆cfDNA中的nMSP第二轮PCR扩增产物；

首先在这5个基因的所有M扩增成功的阳性样本里分别随机选取几个p16阳性样本、几个DLEC1阳性样本、几个CDH1阳性样本、几个DAPK阳性样本及几个RUNX3阳性样本，并挑出这些被选取的阳性样本的甲基化引物M扩增产物，用以验证其是否为真的阳性；

其次在这5个基因的所有只有U扩增成功的阴性样本里分别随机选取几个p16阴性样本、几个DLEC1阴性样本、几个CDH1阴性样本、几个DAPK阴性样本及几个RUNX3阴性样本，并挑出这些被选取的阴性样本的非甲基化引物U扩增产物，用以验证其是否为真的阴性；

(2)PCR产物的连接和转化；

(3)阳性克隆子的筛选；

(4)测序:挑取阳性克隆子对应编号平板上的菌落，沾在600μl的LB-Amp液体培养基中，再置于摇床上，200rpm，37℃，过夜，进行扩大培养；作甲基化测序；

(5)验证：运用Bio analysis软件，结合NCBI上下载的参考序列，与目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各几个被选取的阳性样本中甲基化引物M扩增产物的阳性克隆子测序结果作比对，观察目的片段上CpG岛异常甲基化情况，验证其是否为对应甲基化引物M的正确扩增产物，是否为假阳性；同时，与目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各几个被选取的阴性样本中非甲基化引物U扩增产物的阳性克隆子测序结果作比对，对比目的片段上CpG岛甲基化情况验证其是否为对应非甲基化引物U的正确扩增产物，是否为假阴性；

步骤九，数据分析与统计处理：结合临床资料及健康对照血浆样本，运用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，主要运用卡方检验，P<0.05则差异有统计学意义。