[发明专利]基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法

说明书

技术领域

本发明属于日本血吸虫尾蚴期编码蛋白基因检测技术领域，具体涉及基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法。

背景技术

日本血吸虫是一种重要的人兽共患性疾病，是全球最严重的公共卫生问题之一，主要流行于热带和亚热带的76个国家及地区，全球血吸虫感染人数超2亿人，6亿人口受其感染威胁。全国共有453个血吸虫病流行县(市、区)，总人口2.52亿人；共有29980个流行村，总人口6861.30万人。全国453个流行县(市、区)中，343个(占75.72％)达到血吸虫病传播阻断标准；110个(占24.28％)达到传播控制标准。2015年全国推算血吸虫病77194例，现存晚期血吸虫病人30843例。

日本血吸虫病的诊断包括病原学、免疫学和分子生物学三大方法，而检测日本血吸虫的特异的DNA片段与病原学检测具有同样的确诊价值。病原体基因组学给病原体分子生物学检测带来了新的工作方法和思路。日本血吸虫全基因组测序已经完成，蛋白编码基因13469个，对尾蚴蛋白质组的比较分析，共鉴定出1181个蛋白，将有力地促进与这一重要传染病相关的诊断、治疗和预防的研究。

传统的血吸虫病原学检测方法包括改良加藤法、尼龙袋集卵法、毛蚴孵化法与直肠镜活组织检查法，虽然都是可以确诊的方法，但是由于受到诸多因素的限制，比较耗时费力、且存在一定的漏检率。免疫学方法包括能够检测抗体的环卵沉淀试验、IHA、ELISA、免疫印记技术、IFT、乳胶凝集试验和快速试纸条等方法，虽然具有操作简单、出结果快和经济等优点，但不能区分是现症患者还是既往感染，针对循环抗原的检测方法虽然能够区分现症感染还是既往感染，但由于其在体液中的含量通常都很低，一般难以检出，其敏感性还需进一步加强。

目前，作为一种高效的检测方法，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)不依赖任何专业仪器设备就能实现现场高效快速检测，能避免传统分子生物学方法对于温度循环等条件的特殊要求所带来的不便，具备实用性、高效性和简便性的特点，其使用价值和现场应用价值越来越明显，有望成为较适用于血吸虫现场调查的简易技术方法。

LAMP方法在寄生虫病的研究与应用主要集中在蠕虫和原虫等方面，国内外研究人员已对弓形虫、牛带绦虫、细粒棘球绦虫等寄生虫单基因的LAMP检测做了相关研究，建立LAMP方法，结果显示均有很好的特异性和敏感性。但作为日本血吸虫，还没有相关的报道，并且现有的检测方法相对复杂。

发明内容

本发明的目的是：旨在提供基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法，用来解决现有对日本血吸虫检测不准确，且检测特异性和敏感性不高的问题。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法，包括以下步骤：

步骤一，日本血吸虫动物模型建立及血吸虫样本收集：

A.感染性钉螺经超纯水孵育，肉眼观察水面有尾蚴逸出，接种环接尾蚴置于玻片，解剖镜下观察尾蚴活力，确定尾蚴活动良好，取昆明小鼠10只，腹部剪毛至裸皮肤，取盖玻片置于载玻片上，接种环接30±5只尾蚴于盖玻片，棉球擦拭小鼠皮肤，将载有尾蚴的载玻片贴于小鼠腹部皮肤约30sec～5min，建立小鼠感染血吸虫模型；

B.感染40～50天后，断颈处死小鼠，解剖观察肝脾病理变化，收集日本血吸虫成虫，收集病变肝脏及结肠，置于EP管并在-20℃下保存备用；

步骤二，模板DNA制备：收集钉螺孵育后的超纯水，转至离心管中，在1000～5000r/min条件下离心5～20min，弃上层清液，沉淀用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取尾蚴基因组DNA，感染性钉螺碾碎，收集螺肉及内脏，用软体动物基因组DNA提取试剂盒提取钉螺基因组DNA，提取后的尾蚴基因组DNA和钉螺基因组DNA均置于-20℃备用；

步骤三，候选基因确定：选择日本血吸虫尾蚴期若干个预测蛋白基因作为目的基因；