[发明专利]基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法

权利要求书

1.基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一，日本血吸虫动物模型建立及血吸虫样本收集：

A.感染性钉螺经超纯水孵育，肉眼观察水面有尾蚴逸出，接种环接尾蚴置于玻片，解剖镜下观察尾蚴活力，确定尾蚴活动良好，取昆明小鼠10只，腹部剪毛至裸皮肤，取盖玻片置于载玻片上，接种环接30±5只尾蚴于盖玻片，棉球擦拭小鼠皮肤，将载有尾蚴的载玻片贴于小鼠腹部皮肤约30sec～5min，建立小鼠感染血吸虫模型；

B.感染40～50天后，断颈处死小鼠，解剖观察肝脾病理变化，收集日本血吸虫成虫，收集病变肝脏及结肠，置于EP管并在-20℃下保存备用；

步骤二，模板DNA制备：收集钉螺孵育后的超纯水，转至离心管中，在1000～5000r/min条件下离心5～20min，弃上层清液，沉淀用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取尾蚴基因组DNA，感染性钉螺碾碎，收集螺肉及内脏，用软体动物基因组DNA提取试剂盒提取钉螺基因组DNA，提取后的尾蚴基因组DNA和钉螺基因组DNA均置于-20℃备用；

步骤三，候选基因确定：选择日本血吸虫尾蚴期若干个预测蛋白基因作为目的基因；

步骤四，LAMP引物设计与合成：依据Protein ID，在NCBI网站中搜索、下载并保存步骤三中选择的日本血吸虫尾蚴期的预测蛋白核酸序列的TXT文本，利用DNAStar软件，将核酸序列格式另存为Seq，应用软件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html在线设计LAMP引物；上传核酸序列，设置参数为默认值(Automatic Judgment)，设计引物(Primer design)，如若未有引物自动生成，则修改参数值中的长度和Tm值，再次生成LAMP引物；

步骤五，LAMP引物配置(常温下配置)：

A.引物储存液配置，将步骤四得到的含有LAMP引物干粉的1.5ml离心管放入离心机，在12000～16000r/min的条件下离心1～10min，根据引物干粉物质的量溶解干粉，配置内引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液，配置的母液室温放置数分钟后涡旋仪100～300r/min震荡混匀，随后放入离心机，进行离心；

B.引物工作液PM配置：取步骤五A得到的FIP和BIP各4μl、F3和B3各1μl，然后加入10μl超纯水制备成20μl工作液备用；

步骤六，尾蚴期及感染性钉螺基因组DNA的LAMP检测：

尾蚴期和感染性钉螺基因组25μl LAMP反应体系：12.5μl 2×RM反应液，1μl步骤四得到的引物工作液PM，1μl步骤二得到的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超纯水至25μl，混匀后加20μl密封液再次离心，最后将1μl显色液滴在PCR管盖中间，盖紧管盖，PCR仪内反应，终止反应后颠倒PCR管数次，使显色液和反应混合液充分混匀， 短暂离心后观察反应液颜色变化，若呈现绿色则为阳性(有核酸扩增)，呈现棕红色则为阴性(无核酸扩增)。

2.根据权利要求1所述的基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法，其特征在于：所述步骤二中沉淀用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒为离心柱型。

3.根据权利要求2所述的基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法，其特征在于：所述步骤三中选择日本血吸虫尾蚴期16个预测蛋白基因作为目的基因。

4.根据权利要求3所述的基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法，其特征在于：所述预测蛋白基因包括被膜抗原、钙离子结合蛋白、尿嘧啶核苷磷酸化酶、多巴胺脱羧酶等的编码基因和编码数个假定蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的基于日本血吸虫尾蚴期基因的环介导等温扩增法，其特征在于：所述预测蛋白基因分别为：AY813605.1、AY814178.1、AY815661.1、FN314484.1、CNUS0000038.1、CNUS0000099824.1、CNUS0000102858.1、CNUS0000103096.1、CNUS0000103598.1、CNUS0000103614.1、CNUS0000105310.1、CNUS0000105798.1、CNUS0000106268.1、CNUS0000106483.1、CNUS0000107348.1、CNUS0000107429.1。