[发明专利]用于诊断PAH基因突变的杂交膜条、PCR引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测，特别涉及一种用于诊断苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因突变的杂交膜条及用于扩增待检样品基因片段的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，缩略词为PCR)引物和用于诊断PAH基因突变的试剂盒。

背景技术

苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是严重威胁人类健康的一种常染色体隐性遗传性苯丙氨酸代谢异常病，绝大部分(98％-99％)是由苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因缺陷所致，使得PAH活性下降或缺乏，导致苯丙氨酸不能正常代谢，血液、组织中的丙氨酸及其旁路代谢产物堆积，最终导致中枢神经系统受到不可逆的损害，而出现精神行为异常、癫痫和智力低下等症状。许多研究显示PAH基因突变表现为高度遗传异质性，在不同的民族和人种之间存在较大的差异。我国的平均发病率为1/11188。

苯丙酮尿症可以通过饮食控制治疗，一般需终身采用无(低)苯丙氨酸饮食疗法，早发现早治疗是其治疗的关键，但是昂贵的治疗费用给家庭和社会带来了沉重的经济负担，而且不能从根本上降低PKU患儿的出生率。因此在出生前对胎儿进行诊断，预防患儿出生，能够减少社会和家庭的负担，提高人口素质，具有较高的临床应用价值。

造成苯丙酮尿症的原因一般为遗传因素。苯丙酮尿症绝大部分由PAH基因突变引起，国际上报道的PAH基因突变有500多种，但其中有61.5％是错义突变，13.5％是缺失突变，11.5％是剪切突变，其它还有插入、沉默等多种突变形式。不同种族和地区人群之间PAH基因突变位点及分布具有较大差异。如欧洲最常见的是R408W，IVS10-11G->A，IVS12+1G->A。俄罗斯远东地区PKU患者，发现R408W占63％。通过对古巴的28例PKU病人的检测，发现古巴PKU患者的突变热点为E208K(19.3％)和R261Q(15.8％)。对意大利PKU患者的分析，发现IVS10n-t11G>A(19.4％)和R261Q(13.5％)是意大利PKU患者的突变热点。国际PAH基因研究协作组报道东方黄种人(日本、韩国、中国)的高频突变位点是位于第12外显子的R413P(25％)和位于第7外显子的R243Q(18％)。这为我们大规模有针对性的开展PAH基因突变筛查及诊断提供了理论依据。

目前，传统基因诊断方法包括酶切，限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，直接测序等，这些方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对多个基因突变位点进行检测。而基因芯片法虽然能同时对不同基因位点进行检测，但它所需设备和耗材昂贵，不适用于在临床大规模推广，应用受到限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种用于诊断PAH基因突变的杂交膜条、一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，以及一种用于诊断PAH基因突变的试剂盒。

本发明采用以下技术方案：

一种用于诊断PAH基因突变的杂交膜条，包括基底，以及固定在所述基底上的突变检测探针，每一条所述突变检测探针分别对应包含一个PAH基因突变位点，所述PAH基因突变位点包括以下位点：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V和R413P；每一条所述突变检测探针包含15-25个碱基的序列，在所述序列的中部位置包含其相对应的PAH基因突变位点的突变碱基；所述突变检测探针为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示的序列或其反向互补序列的DNA。

优选的，还包括分别与每一条所述突变检测探针对应的正常对照探针，所述正常对照探针固定在所述基底上的与所述突变检测探针不同的位置上。

优选的，所述正常对照探针为SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.18所示的序列或其反向互补序列的DNA。

优选的，所述突变检测探针的3’或5’端带有氨基标记。

优选的，所述正常对照探针的3’或5’端带有氨基标记。