[发明专利]利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法。

背景技术

植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是指对胚胎或卵子行卵裂球或囊胚滋养层细胞活检，作染色体和(或)基因学检测，再将无遗传性疾病的胚胎植入母体子宫，是一种建立在辅助生育、分子生物学和遗传学基础上衍生出来的一种新的诊断技术。1990年世界上首例经PGD诊断的女婴在英国诞生。此后PGD技术迅速发展，进入20世纪90年代后期，PGD开始普及，目前全世界已报道7693个单基因病的PGD周期。其基本步骤是通过体外受精(in vitro fertilization,IVF)或胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)得到受精卵，经胚胎活检术获取1-2个胚胎卵裂细胞，遗传学分析卵裂细胞后，确定胚胎的遗传组成，选择正常胚胎移植宫内。

PGD技术难点在于检测材料有限而引起的等位基因脱扣率(allele dropout,ADO)的增加，即以单细胞底物诊断单基因缺陷病吋，如在杂合子的单细胞中，两个等位基因之一未被扩增。这是导致PGD误诊的主要原因。1994年Grifo报道了PGD因ADO导致误诊的病例。从而在临床上引起对ADO现象的重视。ADO可以随机作用于两个等位基因中的任何一个。在常染色体显性遗传病中，突变等位基因的ADO可能导致病态胚胎误诊为正常胚胎。ESHRE的指导意见认为ADO率最好小于10％。

目前单基因病PGD(single gene defect PGD，SGD-PGD)多数使用巢式PCR或多重巢式PCR扩增针对突变位点的特异靶向序列扩增，再进行测序或后续的分子生物学分析；或先采用单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)技术对单细胞DNA进行预扩增，再进行后续的分析，由于WGA产物可进行多次、多位点分析，其逐渐成为SGD-PGD的重要途径。WGA是一种旨在以最小的扩增偏倚(amplification bias)完整均一地扩增整个基因组序列的技术，全基因扩增技术包括以热循环为基础的简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和不以PCR为基础的使用随机引物恒温扩增的多重置换扩增(multiple displacementamplification,MDA)技术。近年来，Zong等报道了多次退火环状循环扩增(multiple annealing and loopingbased amplification cycles，MALBAC)技术进行全基因组扩增和后续的高通量测序，MALBAC采用了线性扩增而非传统的指数扩增方式，因而能大幅度提高扩增的均一性，是一种可应用于PGD分析较为看好的全基因扩增技术。到目前为止，单细胞基因扩增诊断仍不能完全避免ADO问题，为了减少单细胞PCR中的ADO而造成的误诊，现有实验室开始引入了胚胎植入前遗传学单体型分析(preimplantationgenetic haplotyping，PGH)策略，通过对胚胎的多个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点检测结合家系单体型连锁分析，理论上可以解决单细胞扩增模板中等位基因丢失的问题。高通量测序技术的出现大大加速了PGH的技术革新，利用目标序列捕获芯片结合高通量测序技术快速筛选致病基因突变位点的SNP单体型信息，结合受检胚胎的SNP信息和突变点分析信息，可有效消除单细胞全基因组扩增过程中ADO的影响，提高SGD-PGD的准确率，可以预见基于高通量测序平台的PGH和基因突变点检测相结合的PGD是未来SGD-PGD的发展趋势。

本发明是基于SGD-PGD的方法学和临床应用研究。目前多家生殖中心已采用冻胚和囊胚移植，尽管有研究表明鲜胚和冻胚的移植成功率无明显差异，且囊胚的妊娠率高于分裂期胚胎，但长时间的体外暴露确是ART安全性评估中不可忽略的因素。根据ESHRE对全球SGD-PGD周期的统计，在所有活检胚胎中，90％为分裂期活检，98％以上都为鲜胚移植。鲜胚移植需要在24-48h之内对胚胎的基因型进行准确的判断，这需要检测中心内部具备测序平台或与公司建立快速服务协议，然而实际操作起来有一定难度。