[发明专利]利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法

权利要求书

1.一种利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，其特征在于，所述利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法包括：

利用高通量测序对单基因遗传病家系进行单体型分析；

建立基于HRM和焦磷酸测序技术以单细胞全基因组扩增产物为模板进行突变检测和单核苷酸多态性分型的分析方法。

2.如权利要求1所述的利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，其特征在于，所述利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法具体包括：

(1)DNA提取：

取5ml外周血，保存于EDTA抗凝管中，充分混匀；

使用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒，完成外周血DNA提取；

样本浓度检测：使用Nano drop2000检测定量，DNA总量不低于3ug，浓度不低于30ng/ul，OD260/280为1.7-2.0；

(2)采用目标序列捕获结合高通量测序，对明确致病的单基因病家系中有生育要求的夫妇及家系中另一位患者或携带者外周血DNA样本进行捕获测序和生物信息学SNP分析，获得该对夫妇致病基因连锁单体型信息；

(3)一代测序验证：对高通量测序所检出的可提供信息的SNP位点，在突变位点上下游1M以内分别选择3个～4个位点，设计引物，以获得单体型信息的三位受检者的外周血DNA为模板PCR扩增，测序；

(4)单个淋巴细胞分离：

取5ml外周血，保存于肝素抗凝管中，充分混匀；

取2ml外周血分离单个淋巴细胞；

(5)全基因组扩增

使用REPLI-g Single Cell kit试剂盒，完成单细胞或卵裂球全基因组扩增提取DNA；

样本浓度检测：使用Qubit Fluorometer检测定量，DNA总量不低于2ug；

电泳检测：扩增范围在300bp～2000bp，阴性对照无条带；

(6)PGD预实验：以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，进行突变检测和SNP分型，测序，计算ADO率；

以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，运用HRM进行突变检测和SNP分型；

以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，运用焦磷酸测序进行突变检测和SNP分型。

3.如权利要求2所述的利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，其特征在于，所述采用目标序列捕获结合高通量测序，对明确致病的单基因病家系中有生育要求的夫妇及家系中另一位患者或携带者外周血DNA样本进行生物信息学分析，获得该对夫妇致病基因连锁单体型信息，具体包括：

gDNA片段化，片段末端修复加接头，构建文库；

捕获前对文库进行重排的连接介导PCR方法扩增；

将扩增后的样品与芯片进行杂交；

芯片清洗，去除未结合序列，然后将捕获序列洗脱下来；

对捕获后样品再次进行LM-PCR扩增；

通过qPCR估计目标区域的相对富集倍数，达到质控要求后进行测序前准备；

高通量测序分析。

4.如权利要求2所述的利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，其特征在于，HRM基因分型包括：

对样本进行PCR反应，需40min～2h；

通过溶解设备对PCR产物进行热变性并采集数据，热变性时间5min～10min；

通过数据分析软件分析，得出突变或SNP的信息。

5.如权利要求2所述的利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，其特征在于，焦磷酸测序基因分型包括：

设计和合成PCR引物，其中一条引物标记生物素；

PCR反应；

DNA双链的分离，含生物素的单链DNA与测序引物的退火；

对含生物素的单链DNA进行测序；

基于焦磷酸测序的突变检测和SNP分析。