[发明专利]林蛙皮中活性成分的集成提取工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种林蛙皮中活性成分的集成提取工艺。

背景技术

东北林蛙(Rana dybowskii)，原称中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)，属两栖纲(Amphibian)无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)蛙属(Rana)，亦被称为哈七蟆、雪哈、田鸡等。广泛分布于我国东北、日本、朝鲜、西伯利亚和俄罗斯，国内主要分布于吉林、辽宁、黑龙江，以及四川、内蒙古的少数地区。东北地区的长白山和小兴安岭最为集中(张鑫，2014)。

东北林蛙中不仅含有丰富的蛋白质，还含有蛙醇、多糖类、磷脂及多种激素等活性物质，是一种集药用、食补和美容功能于一体的珍贵两栖类经济动物(张鑫，2014；刘丹，2013)。

侯召华等(2013)研究响应面法优化林蛙皮中蛋白质提取工艺，结果林蛙皮中蛋白质提取的最佳条件为：料液比30.35，提取时间3.28h，提取温度11.13℃，pH6.01，提取次数为2次，在此工艺条件下，蛋白质的实际提取率为6.11％，利用SDS-PACE得到林蛙皮蛋白质分子量主要集中在43～20KDa。

李慧萍等(2016)研究酶法制备东北林蛙皮胶原多肽及体外抗氧化活性，结果以水解度为指标，确定碱性蛋白酶为最适蛋白酶，其水解林蛙皮胶原蛋白最佳工艺为水解时间5h，底物浓度为6％，酶/底物(E/S)为15％，得到的林蛙皮胶原多肽具有很强的抗氧化活性。

王长周等(2012)研究林蛙皮胶原蛋白肽的制备工艺，选用碱性蛋白酶，加酶量为0.5％，酶解温度为50℃，酶解时间为3h，料液比为1∶3(g/mL)，经脱腥、脱色处理，喷雾干燥，得微黄色粉末状林蛙皮胶原蛋白肽，羟脯氨酸含量为20.69um/mL，分子量分布在3.5ku以下。

南雪等(2015)研究林蛙皮胶原蛋白的提取，在4℃经脱色脱脂处理(过氧化氢浓度为0.025％)后，用0.5mol/L醋酸提取4.8h，沉淀再分别用0.67％、1.34％、2.0％胃蛋白酶提取，在此工艺条件下，酸溶性胶原蛋白(ASC)的提取率为8.77％±0.44％，纯度为75.83％±3.78％，酶溶性胶原蛋白(PSC)的提取率为30.69％±0.83％，纯度为66.39％±1.79％。

赵玉红等(2012)研究超声波-双酶法协同提取林蛙皮多糖的工艺优化，料液比1∶40(g/mL)，超声功率600W，超声处理25min，提取多糖得率1.18％，在超声优化基础上进行双酶处理，酶解条件pH9.0，温度45℃，碱性蛋白酶添加量2.3％，胰蛋白酶添加量2.8％，酶解时间4h，多糖得率为2.286％。

邱方萍等(2013)研究林蛙皮胶原蛋白肽酶解工艺数学建模及抗氧化作用的研究，采用数理统计和数据拟合分析对林蛙皮胶原蛋白肽(LWT)酶解过程中的影响因素进行优化，建立了LWT酶解过程中影响因素与水解度关系的数学模型，验证了水解度的最佳值。

申佳洁等(2015)对林蛙皮胶原蛋白的提取工艺进行了研究表明，用胃蛋白酶对林蛙皮胶原蛋白的提取，酶解时间对林蛙皮胶原蛋白提取率影响最大，酶解时间为48小时，温度为30℃，加酶量为1.5％，料液比为1∶60，在此条件下林蛙皮胶原蛋白的提取率达26.92％。

吕玲玲等(2013)研究林蛙皮胶原蛋白的提取，最佳条件是提取用酶为木瓜蛋白酶，用量为1％，料液比为1∶20(g/mL)，pH5.5，室温提取36h，在此条件下提取率为24.71％，纯度为72.03％。

袁海恋等(2016)研究用响应面法优化林蛙皮中透明质酸提取工艺研究，在单因素实验基础上，料液比1∶40(g/mL)，利用Box-Benhnken中心组合设计原理和响应面分析方法探索了双酶(碱性蛋白酶+胰蛋白酶)酶解温度、时间、加酶量，3个因素作为自变量及其交互作用对透明质酸提取率的影响，确定最佳工艺加酶量55000u/g，酶解时间14h，酶解温度50℃，在此条件下，透明质酸的平均提取率27.6839mg/g，葡萄糖醛酸的含量为13.8420mg/g，转化成百分含量为42.2％。

对上述研究分析后发现仍有下列不足之处：

1、对林蛙皮中的胶原蛋白含量的表示量普遍偏低，干品只有30％左右，测定林蛙皮干品的蛋白含量超过65％，是林蛙产地不同还是别的原因有待研究；

2、只对林蛙皮中一种成分进行提取研究，其他成分废弃，造成宝贵的林蛙皮资源的浪费；