[发明专利]一种用于表达米曲霉葡萄糖淀粉酶的启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于表达米曲霉葡萄糖淀粉酶的启动子及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

米曲霉作为“generally regarded as safe”(GRAS)安全菌株，早在1000多年前已被应用于食品、饲料、产酸、酿酒等发酵工业，是理想的真核表达载体。米曲霉能够产生丰富的淀粉酶系，包括葡萄糖淀粉酶、淀粉水解酶、葡萄糖苷酶等。同时，米曲霉能够天然的积累很多中间代谢物，如有机酸，氨基酸等。现有技术通过对野生型米曲霉NRRL3488进行一系列的代谢改造，获得了一株发酵葡萄糖高产L-苹果酸的重组菌A.oryzae ma37(申请号为201610603538.0的发明专利申请中公开)。将该菌株在以淀粉为唯一碳源的培养基中培养，仍能积累较高浓度的苹果酸(55g/L)。由于淀粉溶液的粘度大，影响发酵过程中的传质和菌体生长，因此，将苹果酸生产工业化，仍需要克服菌体淀粉利用率低的技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种淀粉诱导型的强启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供所述重组启动子的构建方法，是将GenBank:AP007175.1位于1942232～1942328处的97个bp碱基串联五个拷贝。

本发明的第三个目的是提供携带所述淀粉诱导型启动子的载体或细胞系。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，是在启动子PN5或PglaA的介导下，表达编码葡萄糖淀粉酶的基因glaA；所述启动子PN5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码葡萄糖淀粉酶的基因glaA是NCBI Gene ID为5999830的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以质粒pMD19为载体，在启动子PN5或PglaA的介导下，表达所述基因glaA。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子PN5序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖淀粉酶启动子PglaA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是以质粒pMD19为载体，分别与SEQ ID NO.1所示启动子和NCBI Gene ID为5999830的基因glaA连接，转化至米曲霉细胞中。

本发明的第六个目的是提供一种生产L-苹果酸的方法，是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，28～30℃，200～250rpm发酵48～120h。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是按体积以10％的接种量进行接种。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有(按g/L计)：可溶性淀粉100，胰蛋白胨12，K₂HPO₄ 0.15，KH₂PO₄ 0.15，MgSO4·7H₂0 0.1，CaCl₂·H₂0 0.1，NaCl 0.005，FeSO₄·7H₂0 0.005，CaCO₃ 90。

本发明还提供所述基因工程菌在生产有机酸方面的应用。

有益效果：本发明提供的通过构建重组的强启动子提高葡萄糖淀粉酶基因的表达的方法简单有效，经该方法改造后的重组菌株A.oryzae PN5可高效利用淀粉生产L-苹果酸。经过96h摇瓶发酵，PN5可转化100g/L可溶性淀粉生成63g/L的L-苹果酸，与对照相比提高了14.5％。本发明的实验成果为米曲霉发酵生产L-苹果酸提供了新的可用的低廉高效的碳源，也为进一步代谢改造米曲霉生产苹果酸奠定了良好的基础。

具体实施方式

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，胰蛋白胨3，KH₂PO₄ 0.75，K₂HPO₄ 0.75，NaH₂PO₄0.56，K₂HPO₄ 0.56,MgSO4·7H₂0 0.075，CaCl₂·H₂0 0.075，0.75mL微营养液(5g NaCl、5g FeSO₄·7H₂0、1g柠檬酸)。