[发明专利]一种粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因扩增、测序方法及其引物

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因扩增、测序方法及其引物。

背景技术

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)又称灵杆菌，一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。粘质沙雷氏菌广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群，亦是临床上常见的条件致病菌，在机体免疫功能降低时可引起肺部和尿道感染以及败血症。

磷脂酶A1是一类水解磷脂sn-1位酰基的酶类，广泛存在于自然界，在动物、植物和微生物中均有发现。含有磷脂酶A1的微生物主要包括耶和森菌、灰色链霉菌、曲霉菌、假单胞杆菌和沙雷氏菌等。磷脂酶A1主要应用于食品、制药和生物燃料产业。磷脂酶A1在工业上得到广泛应用，目前研究材料多来自于沙雷氏菌属。磷脂酶A1基因(plaA)编码产生磷脂酶，plaS在plaA的下游，也参与磷脂酶基因的表达，plaS编码一段为224个氨基酸的蛋白，该蛋白没有酶活性，可能对于磷脂酶A1基因的表达有辅助作用。因此，为了后续plaA和plaS的研究，建立plaA和plaS全序列扩增和测序方法是十分必要的。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因扩增、测序方法及其引物，目的是能够快速、简便的扩增粘质沙雷氏菌plaA和plaS的全序列。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种用于扩增粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因的引物，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对包括序列号为SEQ ID NO.1的KLSERF3和序列号为SEQ ID NO.2的KLSERR3；所述第二引物对包括序列号为SEQ ID NO.3的KLPERF4和序列号为SEQ ID NO.4的KLSERR4。

引物序列如下：

KLSERF3(SEQ ID NO.1)：5′-TTCCGCATCTCCAACAACCT-3′

KLSERR3(SEQ ID NO.1)：5′-GCCGCGATCTTCACCTATT-3′

KLPERF4(SEQ ID NO.1)：5′-TCGCTTGCTCACACTCACC-3′

KLSERR4(SEQ ID NO.1)：5′-TTGCCGTTGCTCTTCTCGTTC-3′

本发明还提供所述引物在粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因测序中的应用。

所述粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因的测序方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的全基因组DNA；

(2)采用所述引物对全基因组DNA进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)扩增后的产物片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带，并经过纯化后进行测序，得到两个基因片段；

(4)对测序结果进行拼接，得到两个基因的全序列。

步骤(1)采用天根生化科技(北京)有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒提取粘质沙雷氏菌全基因组，并通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。

步骤(2)首先根据plaA和plaS在粘质沙雷氏菌菌株Db11全基因组序列中的相对位置，在其上下游保守区域利用Oligo7软件设计两对专用性引物，之后采用plaA和plaS两对专用引物对奶粘质沙雷氏菌全基因组DNA进行扩增，分别得到两个扩增片段。

所述测序方法还包括采用不同菌株的粘质沙雷氏菌扩增测序并验证引物的专用性。

步骤(3)中PCR扩增后产物的两种条带所含有的DNA片段的长度分别为963bp和756bp。

为了得到更好的扩增效果，步骤(2)中PCR扩增是以25μl的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为2.2μl,模板的用量为2μl。步骤(2)所述PCR扩增的过程中退火温度为50～60℃。

PCR扩增采用25μl反应体系：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO(二甲基亚砜)0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,灭菌水13.47μl。

PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36个循环；最后再72℃延伸10min。