[发明专利]分型和组装不连续基因组元件

说明书

本发明涉及用于分型和组装不连续基因组元件的方法和试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年9月29日提交的美国临时申请号62/234,329的优先权。该申请的全部内容通过引用并入本申请。

技术领域

本发明一般地涉及遗传学、分子和细胞生物学领域，以及尤其涉及用于分型和组装不连续基因组元件和二倍体测序的方法和试剂盒。

背景技术

目前的短读长测序(Short-read sequencing)产生具有较差连续性的基因组数据并因此限制了基因组的从头组装和二倍体单倍型的解卷积。在分型的背景下，每种生物体都具有含有其全部遗传信息的一组定义的染色体。例如，正常人的体细胞是二倍体并且具有两组染色体，即每个细胞核中有父本染色体组和母本染色体组。在每个个体中，这两组染色体在多个基因座具有不同的核苷酸序列。要了解个体的遗传基因组成需要对遗传物质的母本和父本拷贝或单倍型作图。需要对基因组中的各种基因组元件(例如，基因和外显子)进行分型或二倍体测序。虽然存在用于对整个二倍体基因组(Selvaraj等，NBT2013,Dec；31(12):1111-8)或目标基因座(Selvaraj等，BMC Genomics 2015Nov5；16:900)进行单倍型分型的方法，但是仍缺乏将不连续基因组元件单倍型分型成染色体跨距单倍型的方法。

发明内容

本发明通过提供一种在整个染色体或基因组水平上重构和分型不连续基因组元件的方法和试剂盒解决了上述未满足的需求。通过利用邻近连接实验捕获目标基因组元件的3D构造并且因为3D信息是基因组元件的远程信息，本申请所公开的方法和试剂盒能够对外显子进行基因分型并将所有外显子连接成单染色体跨距单倍型。

在一个方面中，本发明提供了一种用于分型和组装不连续基因组元件的方法。该方法包括(i)获得一条或多条染色体的多个基因组DNA片段或基因组序列的数据；(ii)获得来自基因组DNA片段或基因组序列的数据的元件的多个元件序列读出(例如，外显子序列读出)，以及(iii)组装多个元件序列读出(如外显子序列读出)以构建所述一个或多个染色体的远程或染色体跨距单倍型。如本申请所公开的，可以使用maxcut算法进行组装。

在一些实施方式中，可以使用选自下组的技术获得多个基因组DNA片段：Hi-C、3C、4C、5C、TLA、TCC以及原位Hi-C。例如，可以通过使用包括下述步骤的方法获得多个基因组DNA片段(i)提供含有一组具有基因组DNA的染色体的细胞；(ii)将细胞或其细胞核与固定剂孵育一段时间，以便在原位将基因组DNA交联以形成交联的基因组DNA；(iii)将交联的基因组DNA片段化；(iv)将交联的和片段化的基因组DNA连接以形成邻近连接复合体；(v)将邻近连接复合体剪切以形成邻近连接DNA片段；以及(vi)获得多个邻近连接DNA片段以形成文库，从而获得多个基因组DNA片段不连续基因组元件的实例可以选自下组：基因、外显子、内含子、非翻译区、蛋白质结构域编码序列、基因融合、转录因子结合位点、启动子、增强子、沉默子、保守元件、miRNA编码序列、miRNA结合位点、剪接位点、剪接增强子、剪接沉默子、结构变体、常见SNP、UTR调控基序、翻译后修饰位点、共同元件以及任意其他目标元件。

在上述方法中，可以通过使用一种或多种酶进行限制性酶消化进行片段化步骤。优选地，可以使用两种或多种不同的酶进行消化。酶可以是4-切割剂或6-切割剂。在一个实例中，至少一种酶可以选自下组：DpnII、MboI、HinfI、HindIII、NcoI、XbaI和BamHI。

在上述方法中，可以通过包括下述步骤的方法从基因组DNA片段获得多个序列读出(如外显子序列读出)：(i)将多个基因组DNA片段与一组探针杂交以形成杂交混合物；(ii)将杂交的探针分开以分离基因组DNA片段的亚组，以及(iii)将分离的基因组DNA片段测序以产生多个序列读出，从而获得多个序列读出(如外显子序列读出)。如果需要大量的捕获DNA，则在测序步骤之前，该方法还包括扩增分离的基因组DNA片段。