[发明专利]在用户定义的切片组织区域中同时定量多种蛋白质

说明书

本发明尤其涉及用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多路复用检测和定量蛋白质表达的探针、组合物、方法和试剂盒。

相关申请的交叉参考

该申请要求2015年7月17日递交的美国临时申请第62/193819号、2015年12月1日递交的美国临时申请第62/261654号、2016年1月11日递交的美国临时申请第62/277283号和2016年4月15日递交的美国临时申请第62/323018号的优先权。以上提及的申请中的每一个通过参照以其全部结合于此。

发明背景

标准免疫组织化学方法允许同时检测至多6-10种蛋白质靶标，典型的是3-4种靶标。存在对以下的需要：用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多路复用(multiplex)检测和定量蛋白质表达的探针、组合物、方法和试剂盒。

发明概述

本发明涉及用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多路复用检测和定量蛋白质表达的探针、组合物、方法和试剂盒。

本发明的一个方面涉及一种包括以下步骤的方法：(1) 使在或来自组织样本中至少一个细胞的至少一种蛋白质靶标与至少一种包含靶标结合结构域和信号寡核苷酸的探针接触；(2) 向组织样本的位置提供足以释放信号寡核苷酸的力；和(3) 收集并鉴定释放的信号寡核苷酸，从而检测在或来自被提供力的组织样本的特定位置的至少一种蛋白质靶标。特定位置为用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构。靶标结合结构域包含蛋白质结合分子，例如抗体、肽、适体(aptamer)和类肽(peptoid)。在实施方案中，检测到两种或更多种蛋白质靶标。在实施方案中，检测到3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多种靶标及其间的任何数目，例如可检测到800或更多种不同靶标。在实施方案中，检测包括定量每种靶标的丰度。

在实施方案中，方法还包括在组织样本的至少第二特定位置重复至少步骤(2)和(3)，第二特定位置至少包含第二细胞。在实施方案中，检测包括比较在或来自第一特定位置与在或来自至少第二特定位置的至少一种蛋白质靶标的丰度。该至少一个细胞与至少第二细胞可为相同细胞类型或不同细胞类型。在一些实施方案中，检测包括定量在或来自第一细胞类型与在或来自至少第二细胞类型的至少一种蛋白质靶标的丰度。在实施方案中，第一和第二细胞类型独立地选自正常细胞和异常细胞，例如患病和癌性细胞。

在实施方案中，该至少一个细胞直接固定于表面或经至少一个其他细胞间接固定于表面。组织样本可为2-1000 μm厚的组织切片，例如得自福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样本或得自未固定样本。该至少一个细胞可为固定或未固定的。该至少一个细胞可在步骤(2)之前染色或标记，使得染色或标记细胞中的亚细胞或细胞结构能够可视化。或者，对于组织切片，与同探针接触的切片相邻的切片可在步骤(2)之前染色或标记，从而使得能够评价与探针接触的切片中相应细胞或附近细胞中的亚细胞、细胞或组织相关结构。这种染色或标记技术为本领域熟知的。

在以上方面，至少一种探针还包括位于靶标结合结构域与信号寡核苷酸之间的接头(例如可裂解接头)。可裂解接头可为可光裂解的，其通过合适的相干光源(例如激光和UV光源)或合适的非相干光源(例如弧光灯和发光二极管(LED))提供的光裂解。光源可照射至少一个细胞的至少一个亚细胞结构，并且可检测在或来自至少一个细胞的至少一个亚细胞结构的至少一种蛋白质靶标的丰度。而且，光源可首先照射至少一个细胞中的至少一个亚细胞结构并且随后照射至少第二细胞中的至少一个亚细胞结构，使得能够比较在或来自至少一个细胞中的至少一个亚细胞结构与至少第二细胞中的至少一个亚细胞结构的至少一种蛋白质靶标的丰度。

在实施方案中，信号寡核苷酸为单链核酸或部分双链核酸。