[发明专利]使用分裂循环扩增的小核酸定量

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年2月17日提交的美国临时专利申请号62/117,381的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

发明背景

细胞中出现多种类型的非编码短RNA。这类RNA的示例包括但不限于miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。其他类型的RNA包括，例如，mRNA。较短的RNA可尤其存在扩增困难，因为序列不以对于使用标准引物和方法的杂交和扩增而言足够长的序列存在。

对短于30个核苷酸长的核酸靶标的常规PCR扩增和检测可能是困难的。PCR扩增需要用于扩增的引物在反应中使用的聚合酶范围内的温度下退火至靶DNA或RNA。由于PCR需要反应在各循环期间达到90℃或更高以使核酸物质的双链体解链，该聚合酶必须是热稳定的。这通过使用来自超嗜热菌的聚合酶来实现并且产生在以60℃为中心但范围为40℃至75℃的温度下有最佳的功能的酶。随着温度接近温度范围的较低和较高范围，聚合酶变得低效，导致理想的引物解链温度为50℃至65℃。这种要求导致引物的长度为约15至30个核苷酸。因此，对于DNA结合染料检测，最小扩增子或靶标长度是约30-60个核苷酸，并且对于基于Taqman探针的检测，最小扩增子或靶标长度是45-90个核苷酸。这些长度也取决于靶标的GC含量，使得，例如，AT高度富集的靶标需要比GC富集的靶标长得多的扩增子长度。

发明内容

在一些方面中，提供了对样品中靶DNA模板的量进行定量的方法。在一些实施方式中，该方法包括：

a)形成多个混合物划分产物，其中所述混合物划分产物包含：

i)靶DNA模板；

ii)热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶；和

iii)正向和反向扩增引物，其中

所述扩增引物包含3’杂交区域，其与所述靶DNA模板杂交并在所述DNA依赖性DNA聚合酶存在下引发模板引导的引物延伸；

所述正向或反向扩增引物还任选地包含不与所述靶DNA模板互补的5’尾区域；并且

所述正向和反向扩增引物任选地具有超过所述靶DNA模板长度的组合长度；并且

b)在适于通过聚合酶链式反应扩增靶DNA模板的热循环条件下孵育所述混合物划分产物，其中所述热循环条件包括第一组温度循环和第二组温度循环，其中所述第二组温度循环包括比所述第一组温度循环的退火温度高至少5℃的退火温度；并且

c)检测所述混合物划分产物中扩增的靶DNA模板的存在或不存在并确定其中所述靶DNA模板存在时的划分产物的比例；从而对所述样品中靶DNA模板的量进行定量。

在一些实施方式中，正向或反向扩增引物或两者的5’尾区域具有至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％GC含量。在一些实施方式中，正向或反向扩增引物或两者的5’尾区域具有15％至80％、15％至75％、15％至70％、15％至65％、15％至60％、15％至50％、15％至45％、15％至40％、20％至80％、20％至75％、20％至70％、20％至65％、20％至60％、20％至50％、20％至45％、20％至40％、30％至80％、30％至75％、30％至70％、30％至65％、30％至60％、30％至50％、或30％至45％GC含量。

在一些实施方式中，划分产物中的靶DNA模板的平均浓度是0.001-10个拷贝/划分产物。

在一些实施方式中，第一循环条件包括1-15、2-15、5-15、10-15、1-20、2-20、5-20、10-20、15-20、1-10、2-10或5-10个循环。

在一些实施方式中，热循环条件还包括第三组温度循环，其包括比第二组温度循环的退火温度高至少5℃(例如，高至少10℃、15℃或20℃，例如，5-25℃、5-20℃)的退火温度。

在一些实施方式中，第一循环条件包括1-20个以下循环(例如，1-15、2-15、5-15、10-15、2-20、5-20、10-20、15-20、1-10、2-10或5-10个循环)：

i)变性步骤；

ii)组合的引物退火和延伸步骤；和

iii)任选地，在比第一引物退火和延伸步骤高的温度下进行的第二退火和延伸步骤。

在一些实施方式中，第二循环条件包括10-50个循环(例如，10、20、30、40或50个循环)。在一些实施方式中，第二循环条件包括10-50个以下循环(例如，10、20、30、40或50个循环)：i)组合的引物退火和延伸步骤；和ii)变性步骤。