[发明专利]使用分裂循环扩增的小核酸定量

权利要求书

1.一种对样品中靶DNA模板的量进行定量的方法，包括：

a)形成多个混合物划分产物，其中所述混合物划分产物包含：

i)靶DNA模板；

ii)热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶；和

iii)正向和反向扩增引物，其中

所述扩增引物包含3’杂交区域，其与所述靶DNA模板杂交并在所述DNA依赖性DNA聚合酶存在下引发模板引导的引物延伸；

所述正向或反向扩增引物还包含不与所述靶DNA模板互补的5’尾区域；并且

所述正向和反向扩增引物具有超过所述靶DNA模板长度的组合长度；并且

b)在适于通过聚合酶链式反应扩增靶DNA模板的热循环条件下孵育所述混合物划分产物，其中所述热循环条件包括第一组温度循环和第二组温度循环，其中所述第二组温度循环包括比所述第一组温度循环的退火温度高至少5℃的退火温度；并且

c)检测所述混合物划分产物中扩增的靶DNA模板的存在或不存在并确定其中所述靶DNA模板存在时的划分产物的比例；从而对所述样品中靶DNA模板的量进行定量。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述正向或反向扩增引物的5’尾区域或两者都具有至少50％GC含量。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述划分产物中的靶DNA模板的平均浓度是0.001-10个拷贝/划分产物。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一循环条件包括5-15个循环。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述热循环条件还包括第三组温度循环，其包括比所述第二组温度循环的退火温度高至少5℃的退火温度。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述第一循环条件包括5-15个循环的：

i)变性步骤；

ii)组合的引物退火和延伸步骤；和

iii)任选地，在比第一引物退火和延伸步骤高的温度下的第二退火和延伸步骤。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述第二循环条件包括10-50个循环。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述第二循环条件包括10-50个循环的：

i)组合的引物退火和延伸步骤；和

ii)变性步骤。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一循环条件包括低于50℃的退火温度。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述第二循环条件包括至少50℃的退火温度。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增引物与靶DNA模板的相反链杂交，并且侧接具有小于50℃的退火温度的模板DNA的区域。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增引物杂交至靶DNA模板的相反链并且侧接长度为1-30(例如，1-10、8-12、8-20、10-25)个核苷酸的靶DNA模板的区域。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增引物杂交至靶DNA模板的相反链，使得所述引物的3’末端杂交至靶DNA模板中的相邻核苷酸位置。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增引物杂交至靶DNA模板的相反链并且所述扩增引物的3’末端在与靶DNA模板杂交时重叠。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述重叠的长度是1、2或3个核苷酸。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增引物的3’杂交区域的长度是至少3、4、5、6、7、8或更多个核苷酸。

17.如权利要求1或15所述的方法，其中所述扩增引物的3’杂交区域的长度小于10、11、12、13、14、15、20、25或30个核苷酸。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述靶DNA模板的长度小于90个核苷酸。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述靶DNA模板包括与RNA互补的区域，其中与微小RNA互补的区域的长度小于35个核苷酸。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述5’尾区域的长度是至少1、2、3、4或5个核苷酸。