[发明专利]检测寨卡病毒的试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了检测寨卡病毒的试剂盒及其应用，属于PCR检测技术领域。本发明首先通过对寨卡病毒基因组NS4基因序列的比对，确定了在寨卡病毒NS4基因保守区域，并以该保守区为靶序列设计了用于检测寨卡病毒的引物对和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示，本发明还提供了对寨卡病毒进行实时荧光定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，能够对寨卡病毒进行定量检测，且成本低廉，既可用于临床检测也可用于生物制品的质量控制，具有良好的经济价值和应用前景。

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，特别是涉及用于检测寨卡病毒的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行寨卡病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术

寨卡病毒病(ZikaVirusDisease)是由寨卡病毒(ZikaVirus)引起并通过蚊媒传播的一种疾病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。寨卡病毒属黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒，直径20nm，是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，宿主主要为鸟类、啮齿类和哺乳动物。临床特征主要为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，极少引起死亡。世界卫生组织(WHO)认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(吉兰-巴雷综合征)可能与寨卡病毒感染有关。带病毒的伊蚊叮咬是本病最主要的传播途径。亦可通过母婴传播，包括宫内感染和分娩时感染。乳汁中可检测到寨卡病毒核酸，但尚无通过哺乳感染。2015年5月，巴西出现寨卡疫情截至2016年7月，全球共有70多个国家有寨卡病毒传播的证据。寨卡疫情期间，巴西新生儿小头畸形病例数量显著增加，研究证明新生儿小头畸形与妊娠期感染寨卡病毒相关。

由于寨卡病毒与登革热、西尼罗河病毒和黄热病等其他黄病毒会发生交叉反应，因此通过血清学方法做出诊断可能较为困难。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和血中病毒分离培养可以确诊。起病7天内，如果检测到外周血清中寨卡病毒RNA阳性可以诊断，但由于RT-PCR阳性窗比较短(3-7天)，也就是病毒血症期短，因此阳性窗之外阴性结果不能除外感染。荧光定量PCR法具有特异性强，灵敏度高，定量准确、重复性好，检测时间短等诸多优点，可以作为实验室诊断寨卡病毒感染与定量测定寨卡病毒培养物浓度的重要工具。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测寨卡病毒的特异、灵敏、快速、简便的方法以及检测试剂盒。

寨卡病毒包括E、M和C三种结构蛋白和7种非结构蛋白，分别为NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。这些结构蛋白起到控制着病毒的复制，抑制免疫反应的作用。本发明提供的寨卡病毒荧光定量PCR试剂盒，能特异性地检测寨卡病毒NS4基因。

为实现上述目的，本发明通过对NCBI数据库已报道的寨卡病毒基因序列比对，找到了寨卡病毒NS4基因的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测寨卡病毒的遗传标记物。本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。

在本发明的一个实施方式中，优选的特异性引物对的序列为：

上游引物序列为：5'-GGAGTCCCGCTGCTAATGAT-3'

下游引物序列为：5'-TAGTGCGCCACGAGCAAA-3'

荧光探针序列为：

(FAM)5’-T TAACGCCCCTGACCCTAATAGTGGCCA-3’(TAMRA)。

本发明提供了在制备检测寨卡病毒试剂盒中的应用。

进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。

进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对和荧光探针的试剂盒。