[发明专利]重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用

说明书

本发明公开了一种重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用。所述的重组酿酒酵母含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1的外源性基因。本发明进一步公开含有该基因的重组载体及重组酿酒酵母以及利用其进行生物转化合成丙谷二肽的方法。并发现酵母细胞经过多次循环利用后仍具有较高的催化活性，具有明显的产业化优势。本发明所述方法和应用，具有原材料廉价易得、操作简便易控、合成途径绿色高效、生物安全性好、反应速率快、转化率高等优势，为丙谷二肽的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种简洁、高效的丙谷二肽微生物合成方法，尤其涉及应用重组基因工程酵母菌生物转化合成丙谷二肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

丙谷二肽(L-Ala-Gln)在医疗保健等领域具有巨大的应用价值，其更高的溶解度以及良好的热稳定性，已逐渐替代谷氨酰胺(L-Gln)成为主要的肠外营养用药。然而，已知的丙谷二肽合成方法主要有化学合成法和化学加生物酶催化法。化学合成法生产丙谷二肽的过程中一般需要引入和去除保护基团，存在反应步骤多、副产物多、试剂毒性大且非环境友好等问题[中国专利,含L-谷氨酰胺二肽的合成方法,CN1651456；唐果.N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的合成与反应研究.厦门大学,2004；中国专利,丙－谷二肽合成方法,CN1164611C]。由于化学合成法的不足，国内外研究者尝试在化学法基础上添加生物酶如木瓜蛋白酶和青霉素G合成丙谷二肽(于清新.丙谷二肽的酶促合成研究.天津大学，2010.)。以L-丙氨酸甲酯盐酸盐为起始物，通过引入保护基、催化合成肽键、脱保护基三步合成L-Ala-Gln。具体操作中利用木瓜蛋白酶的酰基转移作用催化Phac-L-Ala-OMe和L-Gln合成肽键，再利用青霉素G酰化酶将保护基脱除得到目标产物L-Ala-Gln。虽然其合成步骤有所简化、污染较少，但也存在用酶量大，肽生产率低且仅能催化部分较高疏水性氨基酸等弊端。

近年来，国外研究人员从枯草杆菌中获得了一种氨基酸连接酶(Lal)，能够以无保护的氨基酸作为底物合成二肽[Tabata K,Ikeda H,Hashimoto S.ywfE in Bacillussubtilis codes for a novel enzyme,l-amino acid ligase[J].Journal ofbacteriology,2005,187(15):5195-5202.新的生成肽的酶、生成该酶的微生物和利用它们合成二肽的方法，CN1671840A，日本，2005.DIPEPTIDE PRODUCTION METHOD，United StatesPatent,2006]。但该连接酶属于ATP依赖酶，需要外源提供ATP，使得二肽的生产成本仍然较高，无法在市场大范围推广使用[Tabata K,Hashimoto S.Fermentative production ofL-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineered Escherichia coli strainexpressing L-amino acidα-ligase.Applied and environmental microbiology,2007,73(20):6378-6385.]。

CN105274174A和CN104480075A公开了两种利用生物酶催化生成丙谷二肽的方法，其分别采用生物酶缓冲液或生物酶冻干粉催化底物转化为丙谷二肽，但存在酶分离纯化成本高，酶活低，且难于回收利用，因此限制了其工业化应用的可能。