[发明专利]去糖化的海参次级皂苷及其制备方法

权利要求书

1.去糖化的海参次级皂苷的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

⑴、将干海参烘干并粉碎成粉末；

⑵、取上述干海参粉，乙醇浸提后，减压浓缩得到浸提膏，再冻干得到粗提物；

⑶、将上述粗提物水溶，再用水饱和正丁醇进行多次萃取；然后取上清液减压蒸发得到浸提膏，再水浴蒸干成粉末，得到粗皂苷粉；

⑷、利用大孔树脂柱层析法对上述得到的粗皂苷进行除杂富集，使用乙醇液进行洗脱，检测洗脱液，将含有皂苷的洗脱液减压浓缩，并水浴蒸干成粉末，即为总皂苷；

⑸、正相硅胶柱层析纯化上述得到的总皂苷，检测洗脱液，将含有皂苷的洗脱液减压浓缩，并水浴蒸干，得到富含HA和EA的总皂苷；

⑹、反相硅胶柱层析分离上述富含HA和EA的总皂苷，检测洗脱液，根据洗脱时间，得到两种组分，再分别将对应洗脱液减压浓缩，并水浴蒸干，即得到HA和EA；

⑺、将上述得到的HA和EA分别进行酶解，使用糖苷酶，所述糖苷酶为果胶酶或复合纤维素酶；温度为40-60℃，pH4-6，添加糖苷酶量根据反应物的量来添加，反应时间为3-7d，将反应液进行水饱和正丁醇萃取，将上层萃取液进行减压浓缩，水浴蒸干分别得到：去糖化的海参HA次级皂苷和去糖化的海参EA次级皂苷；所述去糖化的海参HA次级皂苷和去糖化的海参EA次级皂苷是海参皂苷Holothurin A和海参皂Echinoside A的糖链由于糖苷酶酶解脱去后两个糖基而得到的，海参皂苷Holothurin A，简称HA，其分子结构如下所示：

海参皂Echinoside A，简称EA，其分子结构如下所示：

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2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述步骤⑶中水饱和正丁醇萃取皂苷5次，第一次萃取为粗提物水溶后得到的粗皂苷水溶液：水饱和正丁醇是1:3(v/v)进行萃取，然后按粗皂苷水溶液：水饱和正丁醇是1:2(v/v)萃取两次，最后再按粗皂苷水溶液：水饱和正丁醇是1:1(v/v)萃取两次。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述步骤⑷中乙醇洗脱具体为：大孔树脂用量与粗皂苷粉的量的比例是30-80(ml):1(g)，先用50%(v/v)的乙醇溶液洗脱，后用80%(v/v)乙醇溶液洗脱。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述步骤⑸中正相硅胶柱层析的洗脱条件为：正相硅胶用量与总皂苷的量的比例是30-70(g):1(g)，分别用9:1:0.1、8:1:0、7:1:0.1、7:2:0.2(v/v/v)比例的氯仿：甲醇：水进行洗脱，每个比例的洗脱液至少洗脱5个柱体积，再用7:2.5:0.2(v/v/v)比例的氯仿：甲醇：水洗脱至TLC能检测到皂苷，最后用7:3:0.3(v/v/v)比例的氯仿：甲醇：水梯度洗脱至TLC检测不再显色；TLC的条件为：展开剂氯仿：甲醇：水为7:3:0.3(v/v/v)，再用10%-15%(v/v)硫酸乙醇溶液为显色剂，最后在110℃烘箱显色。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述步骤⑹中反相硅胶柱层析的洗脱条件为：反相硅胶用量与富含HA和EA的总皂苷的量的比例是30-70(g):1(g)，先用40%(v/v)的甲醇洗脱，再用60%(v/v)的甲醇溶液洗脱，洗脱液进行减压浓缩，用TLC法检测洗脱液，TLC具体条件为：展开剂70%(v/v)甲醇，10%-15%(v/v)硫酸乙醇溶液为显色剂，在110℃烘箱显色，洗脱液减压浓缩，并于60℃水浴蒸干得到HA和EA两种主要皂苷。