[发明专利]一种热稳定性提高的碱性果胶酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的碱性果胶酶突变体，属于酶工程领域。本发明提供的碱性果胶酶突变体序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体相对于现有的PGL而言，比酶活提高了3.4倍，在60℃的半衰期由原来的5.2min提高到19min，提高了3.6倍。本发明的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α‑1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的碱性果胶酶突变体，属于酶工程领域。

背景技术

果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。

目前对碱性果胶酶研究比较深入的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。综合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母虽然表达蛋白易于纯化，产量高，但发酵周期长、过程复杂、低温诱导耗能高；枯草芽孢杆菌不易表达或表达酶活低等缺点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种碱性果胶酶突变体，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述碱性果胶酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种提高碱性果胶酶热稳定性的方法，所述方法是将SEQ ID NO,3所示碱性果胶酶的N端通过PT-Linker连接SEQ ID NO.4所示的双亲短肽。

在本发明的一种实施方式中，所述PT-Linker序列为PTPPTTPTPPTTPTPT。

本发明的第四个目的是提供表达所述碱性果胶酶突变体的细胞系。

本发明的第五个目的是提供一种产碱性果胶酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主、以pET-22b(+)为载体，表达SEQ ID NO.1所示碱性果胶酶突变体。

本发明的第六个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是以pET-22b(+)为载体，将SEQ ID NO.2所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌中。

本发明的第七个目的是提供一种碱性果胶酶的生产方法，是将所述基因工程菌接种至发酵培养基，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～1.0，加入终浓度0.04～0.06mmol/L的IPTG，于30℃诱导24～72h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将基因工程菌接种至发酵培养基，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～1.0，加入终浓度0.04～0.06mmol/L的IPTG，于30℃诱导48h。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是按体积接种3～5％的种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液是将所述重组菌接种于LB培养基中，于37℃,200～250rpm培养10～12h，获得种子液。