[发明专利]一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒

说明书

本发明提供一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒，利用TaqMan探针多色荧光PCR技术，选择在16S rRNA基因和mip基因序列位点分别设计军团菌特异性的引物探针和嗜肺军团菌特异性引物探针，对引物探针以及扩增体系进行优化验证，确定扩增效果最优的引物探针序列、引物探针的最优组合、最优扩增体系组分浓度以及试验运行程序，检测过程仅凭不同荧光标记的探针检测就能检测出军团菌并对其中的嗜肺军团菌进行区分；同时本发明还引入了人工构建的内参对照，用于避免检测结果的假阴性。本发明的检测结果稳定可靠，试剂盒使用方便，检测灵敏度高，适合于环境、疾控以及临床中军团菌和嗜肺军团菌的快速检测。

技术领域

本发明为一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒。

背景技术

军团菌（Legionella spp）是非典型肺炎(Atypical pneumonias)的主要病原菌之一，军团菌于该病首发于1976年的美国一次军人聚会，故称作军团病。次年从死者肺组织中分离出一种新的病原体，1978年国际上正式将该病原体命名为嗜肺军团菌。军团菌不仅能产生多种毒素和酶，还能诱导人末梢血单核细胞产生前凝血因子活性物质，有助于感染过程中发生播散性血管内凝血。肺部感染后细菌合成的毒素、酶可逆行经支气管、淋巴管及血行播散到其他部位。少数细胞免疫功能低下者，本菌可引起菌血症。军团病常见的多系统脏器损伤主要由毒血症引起，细菌直接侵犯肺外器官组织的情况少见。产生的多种酶和毒素是导致患者死亡的主要原因。军团菌除暴发流行外，多半为散发性社区获得性肺炎。军团菌占社区获得性肺炎的2%～6% ，但在入院的TCU获得性肺炎患者中却占12%～23%，为第二位,仅次于肺炎链球菌，是重症肺炎的重要病原菌，且研究发现，嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)检出率最高，在临床上引起的危害也比其它军团菌属细菌更严重。

军团菌的营养要求苛刻，生长缓慢，在氧气含量低的情况下生长速度会进一步减慢，因此军团菌的最终鉴定需要综合它的生物学特性进行综合分析，即形态、生化性状、分子生物学检测、抗体检测（IFA、ELISA）。(1)显微镜检查：涂片革兰染色及Gimenez 染色，但意义不大(2) 抗体检测作为检测军团菌感染临床常用手段，检测病人血清中抗军团菌IgM及IgG 抗体可以做出特异性诊断。但检测的灵敏度不够，也有出现交叉反应而导致假阳性结果的产生。抗体检测的另一局限性是无法对新出现的血清型进行鉴定，需要制作新的抗体血清。(3)通过传统生化反应观察菌落形态、染色特征和某些生化反应，可以将军团菌鉴定到属的水平。但是大部分传统的生化实验对军团菌都是惰性的。近年来，随着分子生物学的进展，实时荧光PCR技术在病原体检测中得到广泛应用，和传统PCR电泳检测方法比较具有许多优点：(1)其采用的闭管检测消扩增产物污染问题，提高了检测准确度；(2)PCR体系中增加了荧光探针，提高了检测特异性和灵敏度；(3)操作迅速，无需传统PCR的后处理检测步骤，自动化程度高。如果在反应体系中引入内参照和双波长荧光探针，还能监测因样品中可能的PCR抑制剂引起的检测结果假阴性。

目前，临床实验室中已经有利用荧光PCR检测军团菌并区分嗜肺军团菌的报道，例如Templeton等(J Clin Microbiol，2003(41)：4016-4021)利用分子信标(MolecularBeacon)多色荧光PCR技术检测军团菌16S rRNA、mip基因以及外标内参基因PhHV，将嗜肺军团菌和其它军团菌相区分。Stolhaug等(Appl Environ Microbiol，2006(72)：6394-6398)利用FRET探针荧光PCR技术检测军团菌16SrRNA基因，并通过扩增产物的熔解曲线分析将嗜肺军团菌和其它军团菌相区分；但可以分析，由于不同血清型菌株基因序列变化，嗜肺军团菌熔解曲线可能会因特征不明显而导致结果无法判断。