[发明专利]一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒

权利要求书

1.本发明为一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒，其特征在于，基于军团菌靶序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2设计多对引物探针，并对所设计的引物探针进行试验验证、浓度优化，同时对扩增体系中的重要组分及扩增程序进行优化，确定扩增效果最优的引物探针序列、最优扩增体系以及试验运行程序，通过TaqMan探针多波长荧光PCR技术单管扩增检测痰液及肺泡灌洗液中军团菌，并对其中的嗜肺军团菌进行区分鉴别。

2.如权利要求1所述，其特征在于，所用靶序列SEQ ID No.1为军团菌16Sr RNA基因中能用于区分军团菌的保守序列，所用靶序列SEQ ID No.2为军团菌mip基因中能用于特异性区分嗜肺军团菌的保守序列，根据SEQ ID No.1序列优化设计后的引物能扩增其连续145-160个核苷酸，根据SEQ ID No.2序列优化设计后的引物能扩增其连续和90-98个核苷酸，设计的两种TaqMan探针荧光水解探针能分别检测军团菌和嗜肺军团菌，所述引物长度为18～24个核苷酸、探针长度24～26个核苷酸。

3.如权利要求2所述，其特征在于，试剂盒所用的军团菌引物序列可以为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的序列，嗜肺军团菌引物序列可以为SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7的序列；军团菌荧光探针可以为SEQ ID No.8序列，其5’端标记FAM荧光基团；嗜肺军团菌荧光探针可以为SEQ ID No.9序列，其5’端标记HEX；两条探针3’端标记BHQ1淬灭基团；引物探针序列也可以是上述序列同源性大于85％以上。

4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参对照系统包括内参探针和内参DNA。

5.如权利要求4所述，其特征在于，内参引物、探针分别采用SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12序列，探针5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团；内参探针也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。

6.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，包括PCR缓冲液、引物探针、DNA聚合酶、内参对照、阴性对照、阳性对照以及临界阳性对照。

7.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，其特征在于按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：Tris-HCl(pH8.3) 15mM、KCl 75mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM、MgCl₂ 3mM、引物各0.3μM、军团菌荧光探针和嗜肺军团菌荧光探针及内参荧光探针各0.2μM、Taq DNA聚合酶1.2U、UNG酶0.05U。

8.如权利要求1所述试剂盒在军团菌和嗜肺军团菌快速鉴定中的应用，包括以下步骤：(1)样本处理提取模板DNA，样本为痰液、咽拭子、支气管肺泡灌洗液等临床样本或水、空气样品；(2)模板DNA扩增检测，以荧光PCR仪上三个检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中军团菌和嗜肺军团菌存在，从而检测样品中军团菌，并对其中的嗜肺军团菌进行区分辨别。

9.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述的荧光PCR最优扩增程序如下：

[1] 50℃ 2 min

[2] 94℃ 5 min

[3] 94℃ 10 s

[4] 60℃ 45 s

[5] Go to [3] ，5 cycles

[6] 94℃ 10 s

[7] 60℃ 45 s

[8] Go to [6] ，40 cycles

在第[7]步采集FAM、JOE和CY5通道荧光信号

[9] End。