[发明专利]利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法

权利要求书

1.一种利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，包括：

将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以邻氯扁桃腈为底物，以缓冲液为反应介质进行转化反应，反应结束后，对反应产物混合液进行分离纯化，获得R-邻氯扁桃酸；

所述含重组腈水解酶基因的工程菌是由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成。

2.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述底物初始浓度为80～120mM，所述湿菌体的质量终浓度为10～30mg/mL。

3.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述缓冲液为80～120mM pH 7.5～8.5的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液。

4.根据权利要求3所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述缓冲液中添加体积百分数为8％～12％的乙醇作为助溶剂。

5.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，腈水解酶催化水解邻氯扁桃腈制备R-邻氯扁桃酸的反应采用连续流加补料的反应模式。

6.根据权利要求5所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，按1L计，补料时所用的发酵补料培养基的组份包括：

酵母膏40～80g、蛋白胨60～100g以及甘油450～550ml。

7.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：

将含腈水解酶基因的工程菌以体积浓度0.3～0.7％的接种量接种至含终浓度0.03～0.07mM卡那霉素和0.8～1.2mM氨苄青霉素的LB液体培养基中，发酵培养至培养液的OD₆₀₀为0.5～0.7，向培养液中加入终浓度为0.8～1.2mM的IPTG，诱导培养14～18小时后离心收集菌体得到所述催化剂。

8.根据权利要求7所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养温度为36～38℃，所述诱导培养的培养温度为28～32℃。

9.根据权利要求7所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述发酵培养阶段，溶氧量控制在20％～30％。

10.根据权利要求7所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，按1L计，所述LB液体培养基的组份包括：

酵母膏10～14g、蛋白胨12～20g、甘油3～8ml、K₂HPO₄ 20～28g、KH₂PO₄3～4g以及MgSO₄1.5～2.5g。

11.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述对反应产物混合液进行分离纯化的方法为结晶法，具体包括：

经过离心处理后的反应产物混合液，通过浓盐酸进行酸化至pH0.8～1.2，通过旋转蒸发浓缩至1/6～1/2体积，在8～12℃条件下冷却结晶，收集晶体，重复浓缩结晶过程1～3次后，将收集到的晶体溶于乙醇中进行重结晶。