[发明专利]沙门氏菌核酸快速检测试剂盒、试纸及检测方法

说明书

本发明涉及一种沙门氏菌核酸快速检测试剂盒、试纸及检测方法，涉及沙门特异性引物的设计，解旋酶恒温扩增条件的优化，核酸薄膜层析检测试纸条的建立，能够实现核酸检测结果的可视化观察。全部反应过程仅需一个恒温装置，且单一样品从前处理到完成检测，仅需1个小时即可得出检验结果，该方法检测沙门氏菌灵敏度为4.5×10¹CFU/mL，并且与其他常见食源性致病菌无交叉反应，本发明的检测试纸条操作简便、灵敏度高、特异性强、效率高，尤其适用于现场检测以及基层单位的临床诊断。

技术领域

本发明涉及核酸恒温扩增产物的快速检测方法，利用核酸薄膜层析检测试纸条检测目标序列，应用在食源性致病菌的检测过程中，具体涉及一种沙门氏菌解旋酶恒温扩增及核酸薄膜层析检测试纸条。

技术背景

分析以往发生的食品安全事件，细菌性污染引发的食物中毒情况发生频率高，影响程度大，涉及范围广。食源性致病菌导致人类及动物感染疾病的发病率仍居高不下，常见的病原体主要为沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌等。沙门氏菌作为能够导致人畜共患病致病菌在自然界广泛存在，目前已经鉴定的沙门氏菌血清型有2500多种，其中致使食源性的沙门氏菌病发生主要的血清型为肠炎、鼠伤寒和猪霍乱沙门氏菌三种，菌体裂解后释放的内毒素侵袭肠道黏膜、神经及血管，引起头痛、呕吐、腹泻、发热等中毒症状。由此可见食品安全形势依然严峻，有效监控细菌性污染问题成为避免食品污染事件发生的主要解决途径。因此，快速、敏感、特异的检测方法对于临床诊断和保障食品安全是必不可少的。常规标准检测采取传统培养的方法，待测致病菌需按照规定的检测步骤单独进行检测，检测周期长，操作复杂，工作量大，检验人员需要具备专业经验，检测结果易受人为因素影响从而出现误判。

应用免疫学基本原理的检测方法主要依据其抗原与抗体的特异性免疫结合反应。通过微生物本身特异性抗原物质刺激生物体得到相应的特异性抗体。其中采用酶联免疫试剂盒及胶体金试纸条在检测食源性致病菌方面已发展成相当成熟的技术，涉及检测范围广泛。该类产品凭借其操作简便、方便快捷、价格低廉和结果准确等特点，已经逐步进入基层检测及医疗部门甚至被应用于普通家庭自主检测，给人们日常诊断疾病带来许多便利之处。然而免疫技术在目前研究阶段及实际应用中仍存在一些不足之处，主要原因在于单克隆抗体的制备程序繁琐，耗费大量人力及物质资源，由于多方面因素共同作用可能导致得到的抗体特异性并不理想，直接影响检测结果的特异性和灵敏度。在实际检测过程中时常发生假阳性或假阴性的报告，表现出该方法稳定性有待进一步提高。

近年来随着分子生物学的深入研究与快速发展，实际检验中细菌等病原体测定方法已经由传统的单一生化实验水平转移到分子生物学的方法如聚合酶链式反应(PCR)技术、基因芯片、探针杂交等技术。聚合酶链式反应通过特定引物有选择性的进行体外模拟细胞内部扩增DNA或RNA片段的方法，该DNA复制方法可以实现将极少量基因组中的特定基因片段在短暂几小时内呈现指数扩增，显著提高检测的灵敏度已成为目前研究水平上最灵敏的检测技术，具有精确度高和特异性强的优势，在微生物检测、感染性和遗传性疾病的诊断及基因突变的检测等诸多领域发挥重要作用。然而，PCR技术需要精确的热循环过程，局限于反应过程必需依赖精密仪器设备，因而限制了其在设施缺乏的现场检测和基层地区应用。

目前国内外核酸恒温扩增技术迅速发展，现已被广泛应用的有环介导恒温扩增、链替代扩增、滚环扩增、切口酶核酸恒温扩增、依赖解旋酶的恒温扩增等。其反应过程只需在恒定的温度下进行且能够实现DNA或RNA的特异性扩增，并且灵敏度能够达到PCR技术的检测水平。

发明专利“可避免假阴性的沙门氏菌恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法”(公开号CN105219870A)及“肠炎沙门氏菌的链置换恒温扩增(SDA)快速检测试剂盒及其检测方法”(公开号：CN102382884A)描述依据不同扩增原理均以恒温条件实现对沙门氏菌DNA核酸序列的扩增，但该类方法仍需结合凝胶电泳及成像系统对实验数据进行处理分析，没有明显简化检验操作步骤和无法在公共卫生突发事件中体现其优势。