[发明专利]一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用

说明书

本发明公开了一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用，其中高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法是以右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，去除3’端的1584bp碱基、保留上游3000bp碱基dex‑YG‑bMU01后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的BL21(DE3)/dex‑YG‑bMU01基因工程菌。本发明构建的BL21(DE3)/dex‑YG‑bMU01右旋糖酐蔗糖酶基因工程菌，合成的右旋糖酐支链化程度提高，其中的α(1‑3)比例从原来的5％提高到了17％，其水溶液黏度增加，絮凝效果方面得到明显改良，其产酶仍然保持了较高的活性。

一、技术领域

本发明涉及一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用，属于基因工程领域。

二、背景技术

右旋糖酐(dextran)，又称葡聚糖，是蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，主要由α(1-6)糖苷键连接，伴有少量α(1-3)和α(1-4)糖苷键，也可以通过工程菌生产的右旋糖酐蔗糖酶制备。因其具有安全、无毒、生物相容性、结构特异性等多种优点，在食品、医学、色谱分析、材料等多个领域都有了广泛的应用。不同结构的右旋糖酐其物理化学性质都有较大的差异，根据其功能都有其特定的用途，例如由明串珠菌发酵的95％α(1-6)糖苷键的右旋糖酐70是目前公认的优良血浆替代品，由面包酵母发酵的右旋糖酐可作为食品添加剂改善食品的口感。右旋糖酐由于其超高的分子量，和链上的一些活性官能团，可以吸附分散体系中微粒，形成架桥作用，将分散体系中的微粒絮凝沉降下来，右旋糖酐或者改性右旋糖酐(接枝不同的官能团)在絮凝剂方面有很大的应用价值。

目前国内制糖工业采用的传统澄清手段主要是采用石灰和二氧化硫为主要清净剂。混合汁经预灰、一次加热、硫熏中和、二次加热后入沉降器，分离出清净汁和泥汁，泥汁经过滤得滤清汁，它与清净汁混合再经加热、多效蒸发成糖浆，再经糖浆硫熏得清糖浆作结晶原料。或者以石灰和二氧化碳为主要清净剂的蔗汁清净法。其工艺流程为：混合汁经一次加热、预灰，然后在加入过量的石灰乳的同时通入二氧化碳进行一次碳酸饱充，使产生大量钙盐沉淀，随即加热、过滤得一碳清汁，再经第二次碳酸饱充，然后加热、过滤，得二碳清汁，又经硫熏、加热、蒸发成糖浆。然后进行硫漂使pH降至5.8～6.4，供结晶之用。大量的二氧化硫和石灰石的使用，不仅需要投入大量资金，同时对环境和人体也会有很大的影响和危害。而使用蔗糖为底物合成的右旋糖酐作为澄清剂，将会使澄清步骤绿色，无污染，更加节约资源。

分析发现，要完善右旋糖酐作为絮凝剂的生产工艺，有2个关键性问题尚待解决：①因为右旋糖酐结构多样性，其功能也是多样性的，首先要选择分子量和支链化程度适宜的右旋糖酐用作絮凝剂或其絮凝剂前提的研究。②通过基因手段理性设计右旋糖酐技术，要想得到不同结构的右旋糖酐，就要从其上游，右旋糖酐蔗糖酶基因的改造来获得结构特异的右旋糖酐。通过对右旋糖酐基因序列和其表达蛋白三维结构分析，设计合理的基因序列，获得所需结构的右旋糖酐。

迄今为止，有关于改造右旋糖酐蔗糖酶基因生产右旋糖酐应用于絮凝剂的研究在国内外文献未见报道。目前右旋糖酐主要应用于血浆替代品，文献中大多是对右旋糖酐蔗糖酶催化机理，以及蛋白结构分析等基础研究报道，应用方面大多是对原始菌株表达的右旋糖酐应用研究。通过分子生物学手段特异性的改造右旋糖酐，国内外均为见报道。基因改造手段制备目的右旋糖酐工业将是以后国际研究热点和解决问题的关键。

三、发明内容

本发明旨在提供一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用，通过该酶从而改良右旋糖酐性质，使其更适合絮凝剂或絮凝剂前提的研究。

本发明高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌是以右旋糖酐蔗糖酶基因(GenbankNo.DQ345760)为模板，去除3’端的1584bp碱基、保留上游3000bp碱基dex-YG-bMU01后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌。