[发明专利]一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用

权利要求书

1.一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法，其特征在于：将核苷酸序列为SEQID NO：2的dex-YG-bMU01重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌；

所述BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为高枝化型重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)，保藏日期2016年05月12日，保藏编号CGMCC No.12437。

2.根据权利要求1所述的构建方法，包括引物设计、重组质粒构建和宿主菌转化各单元过程，其特征在于：

所述引物设计是根据右旋糖酐蔗糖酶基因序列和载体pET-28a-(+)的序列，借助Primer Primer 5软件设计引物如下：

上游引物选择BamHI作为酶切位点：

5’-----CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT-----3’

下游引物选择Hind III作为酶切位点：

5’---CCCAAGCTTTTATTCTGTCGGTGTGCCA---3’；

所述重组质粒构建是以右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，利用PCR扩增技术，得到含BamH I和Hind III酶切位点截短后的基因克隆片段dex-YG-bMU01；将上述的基因克隆片段用BamHI和Hind III双酶切，酶切产物连接到载体pET-28a-(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01；

所述宿主菌转化是将重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，经过卡那霉素抗性筛选、酶切、菌液PCR和DNA测序验证后，获得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01。

3.一种权利要求1所述的高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的表达应用，其特征在于：

将基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01按0.5％的接种量接种到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培养基中，转速250r/min，35～40℃培养16～18小时；从上述培养液中吸取2mL加入至200mL的A培养基中，放置于37℃下摇床培养，当富集培养的菌液用蒸馏水稀释10倍后的OD₆₀₀在0.20～0.24时即可加入500μL IPTG开始诱导产酶，保持25℃诱导发酵4-6小时，将诱导发酵后的菌悬液在0℃下，6000r/min离心12～15min，一支离心管对应一瓶菌悬液，然后加入蒸馏水振荡清洗，再次离心；向每支离心管中加入20mL pH值5.4的醋酸-醋酸钙缓冲液震荡摇匀，外加冰水浴，超声破碎15min，离心分离，上清液即为粗酶液，酶活80-100U/mL。

4.根据权利要求3所述的表达应用，其特征在于：

所述A培养基中各组分及浓度为：甘油5g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，硝酸钾10g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.105g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NH₄Cl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1mM/L。

5.根据权利要求3所述的表达应用，其特征在于：

摇床培养采用220～240r/min往复式摇床培养或者260～280r/min回转式摇床培养。

6.根据权利要求3所述的表达应用，其特征在于：

诱导发酵采用220～230r/min往复式摇床诱导发酵或者250～260r/min回转式摇床诱导发酵。